Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 13/N 1/2006 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Циркулирующие стромальные остеонектин-положительные клетки-предшественники и стенозирующий атеросклероз коронарных артерий


З.А.Габбасов1, А.А.Агапов2, О.С.Сабурова1, Б.А.Руденко1, Т.В.Балахонова1, Л.Н.Ильина1, Э.Л.Соболева1, Р.С.Акчурин1, В.Н.Смирнов2

1Институт экспериментальной кардиологии, 2Институт клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова, Москва

Цель исследования. Изучение стромальных клеток-предшественников, экспрессирующих маркер остеогенной дифференцировки - остеонектин (ОН), циркулирующих в периферической крови больных со стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий (КА).

Материал и методы. Обследовали 46 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС). Контрольная группа состояла из 5 обследуемых пациентов с непораженными КА и 14 практически здоровых добровольцев. Методом проточной цитофлуориметрии определяли циркулирующие в периферической крови стромальные клетки-предшественники, экспрессирующие ОН.

Результаты. В крови практически здоровых добровольцев и пациентов с нестенозированными КА содержалось небольшое количество остеонектин-положительных (ОН+) клеток (2,38±0,24 и 2,41±0,17д соответственно). У больных ИБС содержание ОН+-клеток составляло в среднем 10,16±0,86д и было значительно и достоверно выше, чем у здоровых добровольцев и пациентов с нестенозированными КА.

Заключение. Высокое содержание обнаруженных в периферическом кровотоке лимфоцитоподобных ОН+-клеток может отражать наличие продуктивного этапа воспалительного процесса сосудистой стенки. Можно использовать этот показатель как диагностический тест для оценки состояния "обострения" атеросклероза.

Ключевые слова: коронарные артерии, атеросклероз, стволовые клетки, остеонектин, лазерная проточная цитометрия.

Z.A. Gabbasov, A.A. Agapov, O.S. Saburova, B.A. Rudenko, T.V. Balakhonova,

L.N. Ilyina, E.L. Soboleva, R.S. Akchurin, V.N. Smirnov

CIRCULATING STROMAL OSTEONECTIN-POSITIVE PRECURSOR CELLS AND SCLEROSING CORONARY ATHEROSCLEROSIS

Aim. To study the stromal precursor cells expressing the marker of osteogenic differentiation - osteonectin (ON) circulating in the peripheral blood of patients with sclerosing coronary atherosclerosis.

Materials and methods. 46 patients with coronary heart disease (CHD) were examined. A control group comprised 5 patients with intact coronary arteries (CA) and 14 apparently healthy volunteers. Flow cytofluorometry was used to determine the peripheral blood circulating stromal precursor cells expressing ON.

Results. The blood of apparently healthy volunteers and patients with non-stenotic CA contained a small number of osteonectin-positive (ON+) cells (2.38±024 versus 2.41±0.17д). In patients with CHD, the content of ON+ cells averaged 10.16±0.86д, which was significantly higher than that in healthy volunteers and patients with non-stenotic CA.

Conclusion. The high content of the lymphocyte-like ON+ cells found in peripheral circulation suggests that there is a productive stage of an inflammatory process in the vascular wall. This parameter may be used as a diagnostic test to evaluate acute atherosclerosis.

Key words: coronary arteries, atherosclerosis, stem cells, osteonectin, laser flow cytometry.

  Стенозирующее поражение коронарных артерий (КА) является сложным комплексным процессом. С улучшением понимания патогенеза атеросклероза сосудов появляется и новый взгляд на маркеры, которые могли бы указать на наличие стенозирующего атеросклероза КА и риск развития сердечно-сосудистых осложнений. В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении клеточных аспектов атерогенеза. Это касается в первую очередь появления все новых данных об участии в атерогенезе костно-мозговых стволовых клеток как гемопоэтической, так и стромальной линий дифференцировки [1-5]. Эти данные позволили предположить, что пролиферирующие в интиме клетки скорее всего имеют костно-мозговую природу, а важным моментом в развитии атеросклероза является проникновение циркулирующих в кровотоке костно-мозговых колониеобразующих стволовых клеток гемопоэтической и стромальной линий дифференцировки в интиму в местах концентрации липидов.
   В этой работе методом проточной цитофлуориметрии исследовали стромальные клетки-предшественники, экспрессирующие маркер остеогенной дифференцировки - остеонектин (OН) и циркулирующие в периферической крови больных с документированным стенозирующим атеросклерозом КА.

Материал и методы
   
Обследовали 46 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС). Клиническое исследование включало физическое обследование больных, запись ЭКГ в покое и при физической нагрузке на велоэргометре, суточное мониторирование ЭКГ, эхокардиографию, коронароангиографию. Некоторым пациентам по показаниям проводили сцинтиграфию миокарда в покое и после индуцированной велоэргометрией ишемии миокарда. Течение заболевания, данные нагрузочных проб и суточного мониторирования ЭКГ свидетельствовали о наличии у пациентов коронарной недостаточности разной степени тяжести. Коронароангиография у всех обследованных пациентов с ИБС выявила критический стенозирующий атеросклероз как минимум двух КА или их магистральных ветвей.
   Контрольная группа состояла из 5 находившихся на обследовании в клинике пациентов с непораженными КА и 14 практически здоровых добровольцев. Наличие ИБС у здоровых добровольцев было отвергнуто данными велоэргометрии. Наличие стенозирующего атеросклероза аорты и ее ветвей в контрольной группе исключали при исследовании ультразвуковыми методами.
   Кровь для исследования брали из локтевой вены пациентов и здоровых доноров утром натощак после 14-часового голодания и стабилизировали ЭДТА.
   Исследование экспрессии различных антигенов клетками крови проводили в течение 2 ч после ее взятия, используя меченные флуоресцеина изотиоционатом (FITC) поликлональные кроличьи антитела к ОН человека (ИМТЕК, Россия), меченные фикоэритрином (PE) моноклональные антитела к CD41 (CD41-РЕ, "Beсton Dickinson", США), меченные CY5-PE (TC) моноклональные антитела к CD45-человека (CD45-TC, "Beсton Dickinson", США). В контроле использовали соответствующие изотипические антитела [кроличьи Ig(G+A+M)-FITC (ИМТЕК, Россия)], мышиные IgG1-PE и мышиные IgG1-TC, "Beсton Dickinson", США). Клеточные аликвоты инкубировали с антителами в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. По окончании реакции в пробы добавляли лизирующий раствор (FACS Lysing Solution, "Becton Dickinson"), через 15 мин клетки центрифугировали при 500 g (15 мин) и отмывали фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,4), фиксировали 1% параформальдегидом и анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur ("Beсton Dickinson"). Сбор и обработку информации производили с помощью программы CELLQuest ("Becton Dickinson"). В каждом образце анализировали по 100 000 лейкоцитов.
   Количество ОН-положительных (ОН+) клеток определенного фенотипа определяли с помощью трехцветной проточной цитофлуориметрии с использованием комбинация антител: ОН-FITC/CD41-PE/CD45-TC. В гейте (группе) лимфоцитов выделяли клетки, которые одновременно экспрессировали CD41 и CD45. Среди выделенных CD41+/CD45+-клеток на графике зависимости бокового рассеяния света от интенсивности флюоресценции ОН-FITC определяли количество ОН+-клеток. Для каждого образца крови проводили контроль связывания изотипических иммуноглобулинов с CD41+/CD45-положительными клетками. Количество OН+/CD41+/CD45+-клеток оценивали в промилле от общего количества лимфоцитоподобных CD41+/CD45+-клеток.
   Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Для статистического анализа использовали непараметрический тест Вилкоксона для независимых групп сравнения. Величины p<0,05 считали статистически значимыми.   

Таблица 1. Характеристика больных ИБС и больных с нестенозированными коронарными артериями

Показатели Больные ИБС (n=46) Пациенты с нестенозированными коронарными артериями (n=5) p
Возраст, лет 59±2 52±3 >0,1
Мочевая кислота, ммоль/л 382±15 363±80 >0,1
Холестерин, ммоль/л 6,3±0,2 6,1±0,6 >0,1
Триглицериды, ммоль/л 1,8±0,2 2,8±0,9 >0,1
Сахарный диабет 9 1 >0,1
Артериальная гипертония 33 4 >0,1

Рис. 1. FACS-анализ OН+-клеток в периферической крови больного ИБС: а - выделение гейта лимфоцитоподобных клеток на диаграмме зависимости бокового рассеяния от прямого; б - связывание меченных FITC изотипических иммуноглобулинов с CD41+/CD45-положительными клетками лимфоцитарного гейта; в - связывание меченных FITC антител к остеонектину с CD41+/CD45-положительными клетками лимфоцитарного гейта.

Таблица 2. Количество OН+/CD41+/CD45+-лимфоцитоподобных клеток у здоровых добровольцев, пациентов с нестенозированными коронарными артериями и больных ИБС

Группа обследованных Число обследованных

Количество OН+-клеток, д

M±m min max
Здоровые добровольцы 14 2,38±0,24 1,18 4,11
Пациенты с нестенозированными коронарными артериями 5 2,41±0,17 1,96 2,92
Больные ИБС 46 10,16±0,86 3,47 22,1
  Количество связанных с изотипическими иммуноглобулинами клеток, д
Всего... 65 0,87±0,12 0,41 1,33

Рис. 2. Количество OН+/CD41+/CD45+-лимфоцитоподобных клеток у практически здоровых добровольцев, больных ИБС и пациентов с нестенозированными коронарными артериями.
1 - здоровые добровольцы (n=14), 2 - больные ИБС (n=46), 3 - пациенты с нестенозированными коронарными артериями (n=5).

Результаты и обсуждение
   
Характеристика исследуемых пациентов приведена в табл. 1. У 46 пациентов было обнаружено критическое поражение КА или их магистральных ветвей. Степень поражения сосудов указывала на необходимость проведения аортокоронарного шунтирования. У пациентов с непораженными КА и здоровых добровольцев не было выявлено поражений аорты и ее ветвей.
   На рис. 1 приведен пример определения количества OН+-клеток в периферической крови больного ИБС. CD41+/CD45+-клетки лимфоцитарного гейта, представленные на рис. 1,б и 1,в, отражают наличие в образцах лимфоцитарно-тромбоцитарных конгломератов. Суммарное количество лимфоцитов, способных связывать тромбоциты, в крови больных ИБС достоверно не отличалось от их количества в крови лиц контрольной группы (4070±280 и 4830±510 соответственно, p>0,1). Однако количество OН+-клеток в этом пуле (лимфоцитоподобных OН+/CD41+/ CD45+-клеток) было значительно выше у больных ИБС, чем в контрольной группе больных.
   В крови практически здоровых добровольцев и пациентов с нестенозированными КА содержалось небольшое количество OН+-клеток (2,38±0,24 и 2,41±0,17д соответственно). Неспецифическое связывание клеток с изотипическими иммуноглобулинами было на уровне 2-4 клеток на 100 000, что соответствовало 0,87±0,12д от количества лимфоцитарно-тромбоцитарных конгломератов. В некоторых случаях у здоровых добровольцев содержание OН+-клеток было очень малым и сравнимым с уровнем связывания клеток с изотипическими иммуноглобулинами. В этих случаях мы не могли уверенно констатировать факт наличия в крови OН+-клеток (табл. 2). У больных ИБС содержание OН+-клеток составляло в среднем 10,16±0,86д и было значительно и достоверно выше, чем у здоровых добровольцев и пациентов с нестенозированными КА (рис. 2). У больных ИБС количество OН+-клеток варьировало в широких пределах, от 3,47 до 22,05д, и всегда было выше, чем у любого из пациентов с непораженными КА. У пациентов с нестенозированными КА наибольшее их количество составляло 2,92д.
   В недавних исследованиях было показано, что появление циркулирующих эндотелиальных клеток в кровотоке может отражать наличие сосудистой патологии и служить биомаркером заболеваний сосудов [6], а недостаток пула эндотелиальных клеток-предшественников может приводить к нарушениям ангиогенеза [7]. Принципиальной находкой в данной работе является обнаружение нового пула циркулирующих лимфоцитоподобных OН+-клеток, количество которых многократно увеличивается у больных со стенозирующим атеросклерозом КА по сравнению с их количеством у здоровых добровольцев и пациентов с нестенозированными КА. Есть несколько важных моментов, которые необходимо отметить при описании этих клеток.
   В настоящее время известно, что неколлагеновый белок костной ткани ОН помимо процессов костеобразования [8, 9] участвует в регуляции множества клеточных и гуморальных реакций организма [10-12]. Несмотря на это, ОН, безусловно, является маркером остеобластной функциональной дифференцировки клеток-предшественников. Иммуноцитохимически была показана локализация ОН в остеопрогениторных клетках, активных остеобластах и в молодых остеоцитах, в то время как в зрелых, покоящихся остеоцитах он не содержится [13].
   До середины 80-х годов прошлого века доказательств возможности циркуляции костно-мозговых стромальных клеток-предшественников практически не существовало. Преобладало мнение о локальной тканевой оседлости стволовых колониеобразующих единиц для фибробластов в постэмбриональном периоде. Только в 1982 г. начали появляться единичные работы, свидетельствующие о возможности циркулирования стромальных клеток-предшественников. Обнаружение гемопоэтических и стромальных стволовых клеток-предшественников в интиме атероматозной аорты человека, а последних также и в периферической крови пациентов с ИБС также свидетельствовало об циркуляции этих клеток в кровотоке и позволило предположить их костно-мозговую природу [14]. Позднее стали появляться работы, подтверждающие циркуляцию в кровотоке костно-мозговых клоногенных колониеобразующих единиц (клеток) для фибробластов, способных попадать в участки воспаления, повреждения и ремоделировать различные ткани организма [15]. Безусловные доказательства присутствия в кровотоке циркулирующих "скелетных" стволовых клеток с остеогенным и адипогенным потенциалом были представлены в последние годы [16]. Сегодня не вызывают сомнения факты циркулирования в крови костно-мозговых стромальных клеток-предшественников и благодаря этому их способности попадать в различные ткани и органы через кровоток как в норме, так и при патологии.
   В настоящей работе мы исследовали популяцию циркулирующих OН-положительных лимфоцитоподобных клеток, способных связывать тромбоциты. Тромбоциты выполняют важную роль во взаимосвязях между воспалением, тромбозом и атерогенезом. Воспалительные процессы характеризуются взаимодействиями между тромбоцитами, лейкоцитами и эндотелиальными клетками. Эти взаимодействия запускают аутокринные и паракринные процессы клеточной активации, которые приводят к накоплению лейкоцитов в сосудистой стенке. Появление в кровотоке тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов способствует развитию острого воспаления через стимуляцию роллинга (скольжения по сосудистой стенке) и последующего захвата лейкоцитов сосудистой стенкой. Образование конгломератов лейкоцитов с тромбоцитами может обеспечивать ускорение доставки клеток крови в места повреждения. Было показано, что эндотелиальные клетки-предшественники через рецептор PSGL-1 и p-селектин взаимодействуют с тромбоцитами, а последние обеспечивают адгезию и роллинг эндотелиальных клеток-предшественников на покрытую коллагеном поверхность. Кроме того, тромбоциты являются источником целого ряда цитокинов и других биологически активных соединений, которые способствуют клеточной пролиферации и дифференцировке [17].
   ОН усиленно экспрессируется клетками, присутствующими в стенке сосуда при прогрессировании атеросклероза, а именно при кальцификации атеросклеротической бляшки [18]. Методами клонального культивирования интимальных клеток из атеросклеротически измененных участков артерий (аутопсийный материал) были обнаружены стволовые колониеобразующие клетки, которые формировали в тест-системах как гемопоэтические, так и стромальные колонии. Клетки в сформированных стромальных колониях синтезировали коллагеновый фибриллярный и остеоидный матриксы [19]. Культивирование клеток мононуклеарной фракции периферической крови пациентов с первичной гиперлипидемией и коронарным атеросклерозом также позволило обнаружить колонии стромальных фибробластоподобных клеток, которые синтезировали фибриллярный и остеоидный внеклеточный матрикс. Клетки в колониях, в которых формировался костный матрикс, экспрессировали ОН. У практически здоровых добровольцев такие стромальные колонии отсутствовали [14]. Эти данные дают основание полагать, что существует тесная взаимосвязь между развитием стенозирующего атеросклероза и появлением в периферической крови костно-мозговых стромальных стволовых клеток-предшественников.
   Высокое содержание обнаруженных в периферическом кровотоке лимфоцитоподобных OН+-клеток может отражать наличие продуктивного этапа воспалительного процесса в сосудистой стенке. Мы полагаем, что количество OН+- клеток можно рассматривать как новый показатель наличия и развития атеросклеротического поражения сосудов человека. Клиническое значение может заключаться в использовании этого показателя как диагностического теста для оценки состояния "обострения" атеросклероза. Определение количества циркулирующих стромальных OН+-клеток может служить новым инструментом для диагностики, прогнозирования течения и лечения атеросклеротических поражений сосудов.   

Литература
1. Chazov EI, Repin VS, Orekhov AN et al. Atherosclerosis: What has been learned studying human arteries. In: Atherosclerosis Reviews (ed. by A.M.Gotto and R.Paoletti) NY, Raven press, 1986; 14: 7-60.
2. Soboleva EL, Popkova VM, Saburova OS et al. Colony-forming units and atherosclerosis. Atherosclerosis X, Elsevier Science, Amsterdam, 1994; 919-25.
3. Caplice NM, Bunch TJ, Stalboerger PG et al. Smooth muscle cells in human coronary atherosclerosis can originate from cells administered at marrow transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100 (8): 4754-9.
4. Sata M. Circulating vascular progenitor cells contribute to vascular repair, remodeling, and lesion formation. Trends Cardiovasc Med 2003; 3 (6): 249-53.
5. Soboleva EL, Gabbasov ZA, Agapov AA et al. Circulating bone marrow stem/progenitor cells in vascular atherogenesis and in non-invasive diagnosis of coronary stenosis. Exper Clin Cardiol 2005; 10 (3): 184-8.
6. Blann AD, Woywodt A, Bertolini F et al. Circulating endothelial cells. Biomarker of vascular disease. Thromb Haemost 2005; 93 (2): 228-35.
7. Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res 2001; 89: e1-e7.
8. Stenner DD, Tracy RP, Riggs BL, Mann KG. Human platelets contain and secrete osteonectin, a major protein of mineralized bone. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 6892-6.
9. Young MF, Day AD, Dominquez P et al. Structure and expression of osteonectin mRNA in human tissue. Connect Tissue Res 1990; 24: 17-28.
10. Sage H, Vernon RB, Funk SE et al. SPARC, a secreted protein associated with cellular proliferation, inhibits cell spreading in vitro and exhibits Ca12-dependent binding to the extracellular matrix. J Cell Biol 1989; 109: 341-56.
11. Rempel SA, Golembieski WA, Fisher JL et al. SPARC modulates cell growth, attachment and migration of U87 glioma cells on brain extracellular matrix proteins. J Neurooncol 2001; 53 (2): 149-60.
12. Wewer UM, Albrechtsen R, Fisher LW et al. Osteonectin/SPARC/BM-40 in human decidua and carcinoma, tissue characterized by de novo formation of basement membrane. Am J Pathol 1988; 132: 345-55.
13. Jundt G, Berghauzer K-H, Termine JD et al. Osteonectin - a differentiation marker of bone cells. Cell Tissue Res 1987; 248: 409-15.
14. Soboleva EL, Shindler EM, Saburova OS et al. Colony-forming units for fibroblasts (CFU-f) in the peripheral blood of patients with primary hypercholesterolemia. In: New pathogenic aspects of atherosclerosis. Nordrhein-Westfalische Academie der Wissenschaffen, Westdeutscher Verlag 1994; 79-93.
15. Ferrari G, Mavilio F. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Scince 1998; 279 (5356): 1528-30.
16. Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S et al. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol 2001; 153 (5): 1133-40.
17. Langer H, May AE, Daub K et al. Adherent platelets recruit and induce differentiation of murine embryonic endothelial progenitor cells to mature endothelial cells in vitro. Circ Res 2005; 22: [Epub ahead of print].
18. Gadeau AP, Chaulet H, Daret D et al. Time course of osteopontin, osteocalcin, and osteonectin accumulation and calcification after acute vessel wall injury. J Histochem Cytochem 2001; 49: 79-86.
19. Romanov YuA, Balyasnikova IV, Bystrevskaya VB et al. Endothelial heterogeneity and intimal blood born cells: relation to human atherosclerosis. Ann NY Acad Sci 1995; 748: 12-37.



В начало
/media/cardio/06_01/10.shtml :: Wednesday, 04-Oct-2006 23:06:02 MSD
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster