Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 13/N 1/2006 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Длительный гипотензивный эффект стабильных динитрозильных комплексов железа у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных крыс


В.Л.Лакомкин, А.А.Тимошин, А.Ф.Ванин*, В.И.Капелько, Е.И.Чазов

Институт экспериментальной кардиологии РКНПК, *Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Москва

Цель работы. Испытание гипотензивного действия доноров оксида азота (NO) – стабильных динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) на нормотензивных крысах линии Wistar и крыс со спонтанной гипертонией (SHR).

Материал и методы. ДНКЖ вводили внутривенно бодрствующим крысам с одновременной регистрацией среднего артериального давления (срАД) через предварительно вживленный в сонную артерию катетер. Содержание ДНКЖ в крови определяли с помощью метода электронного парамагнитного резонанса.

Результаты. Начальное гипотензивное действие ДНКЖ с цистеином было сопоставимо с действием нитропруссида (НП), однако в отличие от последнего при введении ДНКЖ сниженный уровень срАД сохранялся в течение 20–120 мин в зависимости от дозы. Содержание ДНКЖ в крови в это время неуклонно снижалось. Введение цистеина в комплексе с NO без железа (S-нитрозоцистеин) оказывало такое же действие, как и введение НП, а связывание железа в комплексе с батофенантролиндисульфонатом предотвращало снижение срАД. Крысы SHR, отличающиеся от крыс Wistar увеличенным примерно в 1,5 раза срАД, реагировали на введение ДНКЖ с цистеином более значительным и продолжительным снижением срАД. Однако кривая "доза–эффект" для первоначального снижения срАД почти совпадала для крыс Wistar и SHR, 50% эффект достигался при дозировке 0,68 мкмоль/кг. У наркотизированных крыс фаза длительного снижения срАД значительно укорачивалась.

Заключение. Динитрозильные комплексы железа оказывают двухфазный гипотензивный эффект, обусловленный быстрым или замедленным высвобождением NO из комплексов, причем у гипертензивных крыс глубина и длительность вторичного гипотензивного эффекта комплексов были увеличены.

Ключевые слова: динитрозильные комплексы железа, оксид азота, артериальное давление, крысы SHR, нитропруссид.

V.L. Lakomkin, A.A. Timoshin, A.F. Vanin, V.I. Kapelko, E.I. Chazov

Prolonged antihypertensive effect of stable iron dinitrosyl complexes of in conscious

normotensive and hypertensive rats

Aim. To test the antihypertensive effect of the nitric oxide (NO) donors stable dinitrosyl iron complexes (DNIC) on normotensive Wistar and spontaneously hypertensive (SH) rats.

Materials and Methods. DNIC were injected intravenously into the conscious rats, by simultaneously monitoring of the mean blood pressure (BPmean) through the catheter pre-implanted into the carotid artery.

Results. The initial antihypertensive effect of DNIC with cysteine was comparable to that of sodium nitroprusside (SN); however, unlike the latter, DNIC retained lowered BPmean for 20–120 minutes in relation to the administered dose. At that time, the blood level of DNIC steadily decreased. The administration of cysteine in the complex containing NO without iron (S-nitrosocysteine) exerted same effect as SN, and the binding of iron in the complex containing bathophenanthroline disulfonate prevented BPmean lowering. The SH rats differing from the Wistar rats in 1.5-fold elevated BPmean responded to DNIC with cysteine as a more significant and prolonged BPmean reduction. However, the “dose-response” for the original BPmean reduction almost coincided with that for Wistar and SH rats; a 50% effect was reached with a dose of 0.68 mmol/kg. In the anesthetized rats, the phase of a prolonged BPmean reduction was considerably shorter.

Conclusion. Dinitrosyl iron complexes exert a biphasic antihypertensive effect caused by a rapid or delayed NO release from the complexes; the depth and duration of a secondary antihypertensive effect of the complexes being more in hypertensive rats.

Key words: dinitrosyl iron complexes, nitric oxide, blood pressure, SH rats, nitroprusside.

   Оксид азота (NO) является естественным регулятором артериального тонуса, и содержащие его соединения (нитроглицерин, нитропруссид и др.) широко используются в современной кардиологической клинике. Однако вызываемый ими вазодилататорный эффект является непродолжительным, что стимулирует поиск веществ, обладающих пролонгированным гипотензивным действием. Динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), действующим фактором которых является высвобождаемый ими NO, в опытах на животных показали такое действие при помощи сложных процедур [1–4], однако их нестабильность, заставлявшая готовить эти комплексы непосредственно перед введением, крайне затрудняла их использование. Усовершенствование технологии приготовления комплексов (А.Ф.Ванин) позволило стабилизировать их компоненты и использовать для опытов уже готовые ДНКЖ.
   Целью данной работы было испытание эффективности этих ДНКЖ у нормотензивных и гипертензивных крыс.

Материал и методы
   
Мономерные парамагнитные и димерные диамагнитные разновидности ДНКЖ с содержащим тиол лигандом L-цистеином были синтезированы посредством воздействия газообразного NO под давлением 100–200 мм рт. ст. на растворы сульфата железа и L-цистеина с молярным отношением Fe2+ к тиолу 1:20 или 1:2 (ДНКЖ 1:20 или ДНКЖ 1:2) соответственно. Синтез был выполнен в аппарате Тунберга, содержавшем 100 мл газовой смеси и 4,5 мл раствора цистеина. Раствор сульфата железа (0,5 мл) в дистиллированной воде (pH 5,5) и 4,5 мл раствора цистеина в 10 мМ буфере Hepes (pH 7,4) были помещены в верхнюю и нижнюю части аппарата соответственно. После откачки воздуха в аппарат Тунберга добавляли газообразный NO под давлением 100 мм рт. ст. Затем оба раствора встряхивали в течение 5 мин до образования нитрозильного комплекса железа с водой и смешивали в атмосфере NO. После откачки NO из аппарата добавляли сухой декстран к 1 мл раствора ДНКЖ-цистеина (50 или 100 мг декстрана/5mмоль ДНКЖ/1 мл раствора). Смесь тщательно размешивали и лиофилизировали при –10оС в течение 24 ч до остаточной влажности 1%. Метод приготовления запатентован (заявка на патент Российской Федерации №2005137364).
   Работу проводили на бодрствующих самцах крыс линии Wistar массой 300–350 г и на крысах линии SHR массой 250–300 г того же возраста. Под кетаминовым наркозом (100 мг/кг) крысам вживляли катетеры в сонную артерию и яремную вену за сутки до начала эксперимента. После присоединения артериального катетера к электроманометру Gould Statham P23 Db (CША) в течение 15 мин на полиграфе Gould Brush 2400S (США) регистрировали частоту сердечных сокращений (ЧСС) и среднее артериальное давление (срАД) в спокойном состоянии животного.
   В первой части работы сравнивали действие ДНКЖ на основе цистеина с действием нитропруссида натрия (НП). Кратковременность эффекта позволяла испытать несколько доз препарата на одном животном. Вещества, растворенные в 0,5 мл физиологического раствора, вводили в вену и в течение 5 мин регистрировали изменения срАД и ЧСС, а затем вводили следующую дозу вещества для построения кривой "доза – эффект". В качестве контроля использовали введение 0,5 мл физиологического раствора. В отдельных опытах с целью изучения роли железа в эффекте ДНКЖ сравнивали действие свежеприготовленного препарата (в дозе 0,55 мкм/кг) с введением той же концентрации вещества после связывания железа в этом комплексе батофенантролиндисульфонатом (2,9 мкм/кг). Сам комплексон в такой концентрации не оказывал влияния на срАД и ЧСС. Часть животных получали сначала батофенантролиндисульфонат, а затем ДНКЖ. Некоторым животным вводили цистеин, связанный с NO без железа (S-нитрозоцистеин) в такой же концентрации, как и в ДНКЖ.
   Во второй части работы сравнивали действие ДНКЖ у крыс линий Wistar и SHR, при этом использовали данный препарат с разным содержанием цистеина в комплексе (1:2 и 1:20). Действие комплексов на срАД у бодрствующих животных сопоставляли с измерением концентрации ДНКЖ в крови, определяемой при помощи метода ЭПР. В ходе опыта брали образцы венозной крови, к которым немедленно добавляли гепарин (10–20 МЕ/мл). Замороженные образцы хранили в жидком азоте и размораживали непосредственно перед регистрацией спектров ЭПР. Амплитуду сигналов ЭПР ДНКЖ, отражающую его концентрацию в крови, определяли по спектрам ЭПР образцов крови [7]. Спектры регистрировали на спектрометре ЭПР Х-диапазона типа Е-109Е ("Varian", США) при комнатной температуре. Амплитуду модуляции магнитного поля устанавливали на уровне 0,2 мТл при частоте 100 кГц. Частота СВЧ-поля спектрометра составляла 9,15 ГГц, а его мощность – 10 мВт. В специальной серии опытов на крысах SHR изучали действие ДНКЖ у наркотизированных животных (кетамин, 100 мг/кг).
   Результаты представлены в статье как M±m. Достоверность эффектов определяли с помощью t-критерия Стьюдента.   

Результаты и обсуждение
   
Введение бодрствующим крысам ДНКЖ с цистеином (соотношение 1:2) в качестве лиганда вызывало немедленный гипотензивный эффект в течение 15–20 с, степень и скорость развития которого сопоставимы с действием НП, содержавшего в 5,5 раза меньше железа (рис. 1). Увеличенная доза НП, содержавшего равное с ДНКЖ количество железа, вызывала гораздо большее снижение срАД и замедленное его восстановление. Характерным для действия НП было небольшое, но отчетливое превышение срАД над исходным уровнем (см. рис. 1). Быстрое кратковременное снижение срАД при введении ДНКЖ сопровождалось его возвратом до исходного уровня только при малых дозах (0,07–0,27 мкмоль/кг), а при введении более высоких доз (выше 0,55 мкмоль/кг) наблюдалась медленная фаза снижения давления. Она начиналась со 2-й минуты и продолжалась до 15–60 мин и более в зависимости от дозы препарата. При сравнении эффекта НП и ДНКЖ по концентрации железа в препаратах выяснилось, что при равных концентрациях железа в диапазоне 0,02–0,7 мкмоль/кг первоначальный максимальный гипотензивный эффект ДНКЖ был меньше, чем у НП (рис. 2). Через 5 мин эффект ДНКЖ прослеживался уже достаточно отчетливо, в то время как после введения НП срАД возвращалось к исходному уровню или даже несколько превышало его. Введение еще более высокой дозы ДНКЖ (2,74 мкмоль/кг) сопровождалось устойчивым снижением срАД, которое восстанавливалось до исходного уровня только через 2 ч (рис. 3). ЧСС после введения ДНКЖ повышалась от исходного уровня 6,1±0,3 Гц до 7,1±0,4 Гц через 15 мин, до 7,4±0,3 Гц через 30 мин и возвращалась к исходному уровню через 60 мин (6,0±0,4 Гц), сохраняясь на этом уровне в течение второго часа после введения.
   При анализе механизма действия ДНКЖ выяснилось, что наличие железа в комплексе крайне важно для реализации эффекта. Комплекс цистеина с NO без железа – S-нитрозоцистеин – при внутривенном введении вызывал кратковременное падение АД у животных на 1–2 мин, подобно действию НП. С другой стороны, после устранения железа из комплекса батофенантролиндисульфонатом натрия (2,9 мкмоль/кг) инъекция такого препарата уже не снижала срАД, а введение комплексона сразу же за введением ДНКЖ уменьшало эффект последнего. Сам же батофенантролиндисульфонат натрия в такой концентрации не влиял на срАД, но в более высоких дозах (6–9 мкмоль/кг) снижал его.
   Гипотензивный эффект ДНКЖ на основе цистеина был сопоставлен на бодрствующих нормотензивных крысах Wistar и гипертензивных крысах линии SHR. Динамика эффекта у них оказалась весьма сходной, но срАД при введении одинаковой дозы ДНКЖ снижалось сильнее (на 70–80 мм рт. ст. у SHR против 30–40 мм рт. ст. у Wistar). Однако в связи с более высоким уровнем срАД у SHR относительная степень первоначального снижения срАД практически совпадала при действии одинаковой дозы ДНКЖ. При этом степень последующего восстановления АД у крыс линии SHR была выражена гораздо слабее – срАД оставалось значительно сниженным (рис. 4). Таким образом, гипотензивный эффект ДНКЖ у гипертензивных крыс был гораздо более продолжительным. Кривая "доза – эффект" для крыс обеих линий, построенная по величине первоначального эффекта, характеризовалась наличием двух диапазонов (рис. 5). Крутое снижение срАД происходило в диапазоне доз до 0,07–0,14 мкмоль/кг, в то время как при дальнейшем увеличении дозы ДНКЖ степень эффекта прирастала умеренно. Эти результаты позволяют думать, что гипертензивные крысы характеризуются нормальной чувствительностью срАД к начальному действию ДНКЖ, в основе которого лежит быстрое высвобождение NO, но замедленным восстановлением АД при пролонгированном высвобождении NO.
   У обеих линий крыс величина амплитуды сигналов ЭПР достигала максимума сразу после введения ДНКЖ и далее монотонно снижалась, причем кинетика уменьшения этой величины оказалась практически одинаковой у крыс линии Wistar и SHR (рис. 6). Наибольшее снижение амплитуды сигнала ДНКЖ наблюдалось в период наибольшего гипотензивного эффекта.
   Изменение количества цистеина в комплексе (1:20 или 1:2) практически не повлияло ни на начальный, ни на пролонгированный гипотензивный эффект у бодрствующих крыс SHR. При этом у крыс Wistar снижение срАД под влиянием ДНКЖ–цистеин 1:20 было весьма кратким (около 10 мин), а через 0,5–2 ч сменялось умеренным повышением срАД (рис. 7).
   Гипотензивный эффект ДНКЖ проявлялся также у наркотизированных крыс линии SHR, при этом степень начального снижения срАД оказалась более глубокой по сравнению с эффектом у бодрствующих животных (рис. 8). Однако восстановление АД через 1,5–2,0 мин у наркотизированных крыс происходило более круто, и срАД стабилизировалось на близком к исходному уровне. У бодрствующих крыс фаза длительного снижения срАД была глубже и продолжительнее. Это означает, что в условиях наркоза реализация длительного гипотензивного эффекта затрудняется.

Рис. 1. Динамика срАД бодрствующей крысы линии Wistar при внутривенном введении нитропруссида 0,1 мкмоль/кг (НП-1) и 0,4 мкмоль/кг (НП-2), а также ДНКЖ (0,55 мкмоль/кг). Момент введения показан стрелкой. Содержание железа в препаратах 1,7; 6,7 и 9,3 мкг соответственно. Шкала времени после 100 с изменена для большей наглядности.

Рис. 2. Зависимость относительной величины срАД на максимуме гипотензивного эффекта (нижние кривые) и через 5 мин (верхние кривые) после введения нитропруссида (квадраты и треугольники соответственно) и ДНКЖ с цистеином (кружочки и ромбы соответственно) от содержания железа в веществах.

 

Рис. 3. Относительная динамика срАД после введения ДНКЖ с цистеином (2,74 мкмоль/кг) бодрствующей крысе. Величины представлены как M±m.

 

Рис. 4. Относительная динамика срАД бодрствующих крыс линии Wistar (кружочки) и линии SHR (квадраты) после введения ДНКЖ с цистеином (1:20) в дозе 2,74 мкмоль/кг.

Рис. 5. Зависимость от дозы максимального гипотензивного эффекта ДНКЖ с цистеином (1:20) у бодрствующих крыс линии Wistar (треугольники) и линии SHR (квадраты).

Рис. 6. Кинетика амплитуды сигнала ЭПР ДНКЖ с цистеином 1:20 в крови крыс линий Wistar и SHR после болюсного внутривенного введения препарата в дозе 2,74 мкмоль/кг.

Рис. 7. Относительная динамика срАД бодрствующих крыс линий Wistar (треугольники) и SHR после введения ДНКЖ с цистеином. Соотношение железа и цистеина 1:20 (Wistar и SHR, треугольники и квадраты) и 1:2 (SHR, кружочки).

Рис. 8. Гипотензивный эффект ДНКЖ с цистеином 1:20 в дозе 2,74 мкмоль/кг у наркотизированных (квадраты) и бодрствующих (кружочки) крыс линии SHR.


   Результаты исследования показали, что стабилизация комплексов железа не нарушает их ранее установленного [2, 3] гипотензивного эффекта и тем самым была продемонстрирована адекватность метода приготовления ДНКЖ. При этом в полной мере сохранились все присущие им свойства – длительность гипотензивного эффекта, выгодно отличающая ДНКЖ от действия НП, более глубокое снижение АД у наркотизированных крыс, чем у бодрствующих. Стабилизация ДНКЖ, сохраняющая их основные свойства, значительно облегчает их возможное применение в качестве гипотензивного средства.
   Как показали наши опыты, наличие железа очень важно для проявления гипотензивного эффекта ДНКЖ. Отсутствие железа в комплексе или его связывание делают эффект кратковременным подобно эффекту НП. Вместе с тем само наличие железа в молекуле не является гарантом развития длительного гипотензивного эффекта, так как нитропруссид, также содержащий железо, не способен оказывать длительное действие, хотя при равном с ДНКЖ количестве железа снижает срАД более глубоко (см. рис. 2). Совокупность этих фактов хорошо объясняется ранее предположенным механизмом действия ДНКЖ [4–6]. Особенность молекулы ДНКЖ состоит в том, что железо связано с тиоловыми группами и их окисление способствует постепенному высвобождению NO из комплекса, обеспечивая тем самым пролонгированный гипотензивный эффект. Более продолжительное снижение срАД под влиянием ДНКЖ, чем под действием НП, напоминает эффект ацетилхолина, и по этой причине действие ДНКЖ, вероятно, более близко к действию реального зависимого от эндотелия фактора расслабления (EDRF), чем собственный эффект NO [4, 5].
   Способность комплексов длительно снижать срАД нарастала с увеличением дозы. Глубина и длительность гипотензивного действия соответствовали скорости распада комплексов в крови – ускоренный распад ДНКЖ сочетался с относительно непродолжительным эффектом. Форма спектров ДНКЖ указывала на их связь с белками плазмы и гемоглобином эритроцитов [7], что обусловливало замедленное высвобождение NO.
   Глубокое и длительное снижение срАД, несомненно, требует усиления сократительной функции сердца для стабилизации минутного объема, и косвенным свидетельством такого компенсаторного изменения является отчетливое повышение ЧСС. Она возрастает тем сильнее, чем глубже снижение срАД, и нормализуется после приближения срАД к исходному уровню. Скорее всего происходило также и увеличение силы сердечных сокращений как части компенсаторного возбуждения симпатического отдела вегетативной системы, однако это требует проведения специальных опытов. Повышенная активация симпатического отдела при наркозе [8] сочеталась в наших опытах с ускоренным восстановлением срАД по сравнению с эффектом той же дозы ДНКЖ с цистеином у бодрствующих животных.
   В наших опытах было подтверждено показанное ранее [3] более глубокое снижение срАД у крыс линии SHR, чем у нормотензивных, однако относительное падение срАД оказалось одинаковым как по степени, так и в зависимости от дозы (см. рис. 4, 5). Это позволяет предполагать, что чувствительность артерий к NO у крыс с наследственной гипертонией сохранена. Вместе с тем фаза продолжительного снижения срАД у этих животных оказалась гораздо более глубокой и длительной. Этот потенциально важный для возможного лечебного применения факт не поддается однозначной оценке. В его основе могут лежать как ускоренное высвобождение NO из комплексов под влиянием повышенного окисления тиоловых групп в плазме, так и замедленная нейтрализация действия NO в самих гладкомышечных клетках.
   Результаты данной работы позволяют заключить, что: 1) гипотензивный эффект ДНКЖ напоминает действие ацетилхолина и тем самым молекула ДНКЖ может рассматриваться как реальный зависимый от эндотелия фактор расслабления; 2) стабильная форма ДНКЖ позволяет длительно хранить препарат и потенциально пригодна для дальнейшей работы по созданию лекарственного средства; 3) ДНКЖ показали себя как эффективное средство длительного снижения срАД у крыс линии SHR.   
   Работа выполнена с частичной поддержкой гранта РФФИ №05-04-49751а, гранта РФФИ №НШ-8521.2006.7. и гранта РФФИ №04-04-08116.

Литература
1. Kleshchev AL, Mordvintcev PI, Vanin AF. Role of nitric oxide and iron in hypotensive action of nitrosyl iron complexes with various anionic ligands. Studia Biophys. 1985; 105: 93.
2. Мордвинцев П.И., Путинцев М.Д., Галаган М.Е. и др. Гипотензивная активность у наркотизированных животных динитрозильных комплексов железа с белками. Бюллетень ВКНЦ. 1988; 1: 46–51.
3. Галаган М.Е., Орановская Е.В., Мордвинцев П.И. и др. Гипотензивный эффект динитрозильных комплексов железа на бодрствующих животных. Бюллетень ВКНЦ 1988; 2: 75–80.
4. Vedernikov YP, Mordvintcev PI, Malenkova IV, Vanin AF. Similarity between the vasorelaxing activity of dinitrosyl iron cysteine complexes and endothelium-derived relaxing factor. Eur J Pharmacol 1992; 211 (3): 313–7.
5. Vanin AF. Endothelium-derived relaxing factor is a nitrosyl iron complex with thiol ligands (Hypothesis). FEBS Letters 1991; 289: 1.
6. Vanin AF, Muller B, Alencar JL et al. Evidence that intrinsic iron but not intrinsic copper determines S-nitrosocysteine decomposition in buffer solution. Nitric Oxide 2002; 7 (3): 194–209.
7. Тимошин А.А., Орлова Ц.Р., Ванин А.Ф. и др. Экзогенные динитрозильные комплексы железа с тиосульфатом в крови кролика. Рос. хим. журн. 2006, в печати.
8. Garruba MD, Boudilotti GP, Catteruccia H et al. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol 1987; 134 (1): 15–24.



В начало
/media/cardio/06_01/42.shtml :: Wednesday, 04-Oct-2006 23:07:09 MSD
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster