Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 01/N 2/2006 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Влияние нейропептида FF на систему кровообращения у бодрствующих крыс


Е.И.Чазов, В.Л.Лакомкин**, В.Д.Гончарук**, М.В.Сидорова**, В.П.Мох**, В.М.Мартемьянов**, А.В.Кузьмин**, Ж.Д.Беспалова**, В.Б.Сергиенко*, В.П.Масенко*, В.И.Капелько**

*Институт клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова, **Институт экспериментальной кардиологии, Москва

Цель исследования. Изучение функциональных эффектов пептида in vivo и на изолированных сосудах.
Материал и методы. Бодрствующим крысам внутривенно вводили пептид, измеряли уровень катехоламинов и распределение меченого пептида в органах.
Результаты. В диапазоне доз 0,1–1 мг/кг пептид в зависимости от дозы быстро в пределах 15–20 с повышал артериальное давление (АД) на 10–40 мм рт. ст. и частоту сердечных сокращений (ЧСС) на 18–40 уд/мин. Эффект исчезал примерно через 40 с и мог быть повторно воспроизведен у того же животного. Между степенью изменения АД и ЧСС установлена положительная корреляция (r=0,93). В образцах крови, взятых на высоте эффекта пептида, обнаружено повышение уровня норадреналина в 4,5 раза и адреналина в 2 раза. Распределение пептида в органах, изученное при помощи меченого модифицированного пептида, показало, что он преимущественно накапливается сначала в печени, а впоследствии в кишечнике. Связывание в остальных органах незначительно. Пептид в широком диапазоне концентраций не влиял на тонус изолированных полосок аорты. Применение иммуногистохимического метода позволило выявить места связывания пептида в сосудах головного мозга.
Заключение. Полученные результаты указывают на центральное действие пептида, сопряженное с активацией симпатического отдела автономной нервной системы.
Ключевые слова: нейропептид FF, артериальное давление, частота сердечных сокращений, катехоламины.


E.I. Chazov, V.L. Lakomkin**, V.D. Goncharuk**, M.V. Sidorova**, V.P. Mokh**, V.M. Martemyanov**, A.V. Kuzmin**, Zh.D. Bespalova**, V.B. Sergienko*, V.P. Masenko*, V.I. Kapelko**
*
A.L. Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, ** Institute of Experimental Cardiology, Moscow

Effect of the neuropeptide FF on the circulatory system of awake rats

Aim. To study the functional effects of the peptide in vivo and on isolated vessels.
Materials and methods. The peptide was intravenously injected into awake rats; the level of catecholamines and the visceral distribution of the labeled peptide were measured.
Results. Given in doses of 0.1–1 mg/kg, the peptide rapidly (within 15–20 sec) elevated blood pressure (BP) by 10-40 mm Hg and heart rate (HR) by 18–40 beats/min, depending on its dose. After approximately 40 min, the effect disappeared and could be reproduced in the same animal. A positive correlation was established between the magnitude of BP and HR changes (r = 0.93). The blood samples taken at the peak effect of the peptide displayed 4.5- and 2-fold increases in the levels of norepinephrine and epinephrine, respectively. The visceral peptide distribution examined by means of the labeled modified peptide indicated that the latter mainly accumulated first in the liver and then in the bowel. Its binding was slight in other organs. When used in a wide range of concentrations, the peptide did not affect the tone of isolated aortic striae. The immunohistochemical technique could reveal peptide binding sites in the cerebral vessels.
Conclusion. The findings suggest that the peptide shows the central action associated with the activation of the sympathetic portion of the autonomic nervous system.
Key words: neuropeptide FF, blood pressure, heart rate, catecholamines.

Введение
   
Нейропептид FF (H-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2) является членом пептидной группы RF-амидов, локализован главным образом в головном мозге, где его рассматривают в качестве модулятора действия морфина. Вместе с тем известно, что введение пептида в желудочки мозга модулирует функцию автономной нервной системы [1], а постоянное наличие небольших количеств пептида в крови [2] предполагает его участие в регуляции системы кровообращения и функций внутренних органов. Рецепторы к нейропептиду FF у крыс и человека обнаружены в нейронах гипоталамуса и гипофиза, связанных с регуляцией сосудистого тонуса [3–5], причем установлена тесная связь между локализацией рецепторов с синтезирующими катехоламины ферментами в нейронах солитарного тракта [6].
   Внутривенное введение пептида крысам кратковременно повышало АД и ЧСС [7–11]. Однако механизм этого эффекта остался неясным, в частности, не выявлено место приложения действия пептида. Одни авторы полагают, что пептид высвобождает норадреналин из симпатических нервных окончаний [7, 9], другие считают, что он может действовать через центральную нервную систему [12, 13]. Предполагают, что пептид может осуществлять свое вазопрессорное и тахикардическое действие (как и родственные ему меланокортины) через рецепторы, расположенные в антеролатеральной области 3-го желудочка, которая находится перед гематоэнцефалическим барьером и легко достигаема для растворенных в крови веществ [13]. Вместе с тем обнаружение рецепторов к пептиду в сердце [10] и сосудах головного мозга [4] позволяет предполагать прямое воздействие на периферическое кровообращение.
   В целях дальнейшего изучения данной проблемы в настоящей работе, впервые проведенной на бодрствующих животных, помимо физиологического анализа действия пептида на систему кровообращения при его внутривенном введении, было также испытано его прямое действие на изолированные сосуды. Кроме того, для изучения связывания и распределения пептида в организме была проведена модификация молекулы пептида, позволившая прикрепить к нему 99Тс.   

Материал и методы
   Синтез пептидов.
Пептиды синтезировали по стандартной программе автоматическим твердофазным методом на автоматическом пептидном синтезаторе Applied Biosystems, модель 431А (Германия) с использованием Fmoc-методики. Пептидную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная синтез с С-конца. Синтетический цикл включал деблокирование a-аминогрупп 20% раствором пиперидина в NMP в течение 20 мин, 20-минутную активацию 1 ммоля присоединяемой аминокислоты в присутствии эквивалентных количеств DIC и НОВТ в NMP, конденсацию с 1 ммоля (4-кратным избытком) активирующего агента, полученного таким образом, в течение 37 мин и все необходимые промежуточные промывки пептидилполимера. В качестве нерастворимого носителя был выбран сополимер стирола с 1% дивинилбензола с кислотолабильной якорной группой PAL, предназначенной для синтеза амидов пептидов. Для создания амидных связей использовали карбодиимидный (DIC/HOBt) метод. Для присоединения 99Тс метки к пептиду была создана его MAG3-модификация (Bz-S-CH2CO-(Gly)3-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2) посредством конденсации соответствующего октапептидилполимера с S-бензоил-меркаптоацетилтриглицином в присутствии тех же реагентов в течение 16 ч. Для заключительного деблокирования и отщепления пептидов от носителя применяли трифторуксусную кислоту со специальными добавками – "скэвенджерами". Сырые продукты твердофазного синтеза очищали с использованием препаративной ВЭЖХ до 98% чистоты и характеризовали с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Молекулярная масса NPFF – 1082, MAG3-NPFF – 1430.
   В работе использовали производные L- и D-аминокислот фирмы "Bachem" (Швейцария), D1C, HOBt, TIBS фирмы "Fluka" (Швейцария). Для твердофазного синтеза пептидов применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту фирмы "Applied Biosystems GmbH" (Германия). Аналитическую и препаративную ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы "Gilson-305" (Франция), для аналитической ВЭЖХ использовали колонку Ultrasphere ODS, 5 мкм (4,6 ґ 250 мм) "Beckman" (США). Масс-спектры регистрировали на масс-спектрометре Analytical Compact MALDI 4 фирмы "Kratos" (Великобритания). 1H-ЯМР-cпектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (Германия) в DMSO-d6 при 300°К5, концентрация пептидов составляла 2–3 мг/мл. Для получения амидов пептидов применяли PAL-полимер ("PerSeptive Biosystems", Германия) с содержанием аминогрупп – 0,37 ммоль/г, исходили из 0,25 ммоль Fmoc-аминоацилполимера.
   Опыты in vivo проводили на бодрствующих самцах крыс линии Wistar весом 300–350 г. Под кетаминовым наркозом (100 мг/кг) крысам вживляли катетеры в сонную артерию и яремную вену за 1 сут до начала эксперимента. После присоединения артериального катетера к электроманометру Gould Statham P23 Db (CША) в течение 15 мин регистрировали среднее АД (САД) и ЧСС в спокойном состоянии животного на полиграфе Gould Brush 2400S (США). Нейропептид FF (1 мг/мл) вводили в яремную вену с 0,5 мл физиологического раствора.
   При измерении концентрации катехоламинов в крови крысам для компенсации кровопотери предварительно вводили 2 мл физиологического раствора с 500 МЕ гепарина за 5 мин до первого взятия крови. Из вены отбирали 2 мл крови в пластиковую пробирку, обложенную льдом, в которой находилось 40 мкл 10% свежеприготовленного раствора ЭДТА и 20 мкл 10% раствора метабисульфита натрия. Кровь центрифугировали при 3500g в течение 10 мин при 4oС. Плазму отбирали в пластиковую пробирку, замораживали и хранили в жидком азоте. Повторное взятие крови осуществляли на высоте эффекта пептида не менее чем через 20 мин после первого. Экстракцию катехоламинов осуществляли стандартным методом с использованием оксида алюминия. Разделение проводили в ион-парном варианте обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Reprosil-Pur C18 AQ. Подвижная фаза состояла из 10% ацетонитрила и 90% 100 мМ цитратно-фосфатного буфера (рН 5,0), содержавшего 250 мг/л октансульфоната натрия. Детектирование в хроматографической системе Perkin-Elmer 200 осуществляли с помощью электрохимического детектора ESA Coulochem III с аналитической ячейкой 5011 при рабочем напряжении 0,32 V и скорости потока 0,5 мл/мин. Для подсчета данных использовали программу TotalChrom с помощью метода внутреннего стандарта (ДГБА).
   Опыты на изолированных полосках аорты крыс проводили как при сохраненном, так и при механически удаленном эндотелии. Полоски помещали в термостатированную (37,5 oС) камеру объемом 10 мл, заполненную стандартным раствором Кребса–Хензеляйта, насыщенным карбогеном. Регистрировали напряжение полосок при помощи изометрического датчика UC-2 ("Gould", США) и 3-канального самописца Linear. Полоску растягивали грузом 1–1,5 г в течение 60–90 мин, через каждые 15 мин меняли раствор. Исследовали действие пептида в концентрации 10-5–10-9 М на исходный тонус и на повышенный норадреналином (10–7 М).
   Иммуногистохимическое исследование. Для идентификации рецепторов к FF использовали антитела к FF1, любезно предоставленные доктором Q.Liu (Department of Neurosciences, Merk Research Laboratories) и проверенные на специфичность [4]. Локализацию мест связывания FF1 в сосудах головного мозга выявляли с помощью иммуногистохимического исследования криостатных срезов [4].
   Связывание пептида в организме. Сканирование крыс, которым вводили меченный 99Тс пептид MAG3-NPFF, проводили на 2-детекторной гамма-камере с параллельным коллиматором высокого разрешения. Запись статического изображения в передней проекции с набором 500 тыс. импульсов на проекцию начинали через 10 мин после введения препарата. На полученном изображении сравнивали зоны изучаемого органа и фона, оценивали суммарную активность импульсов данной зоны и удельную активность зоны, рассчитанную на ячейку матрицы детектора.   

Результаты
   
Введение нейропептида FF бодрствующим крысам оказывало немедленный эффект, выражавшийся в повышении АД и ЧСС. Пик эффекта достигался через 10–15 с, а стабилизация до исходного уровня в зависимости от дозы занимала 40–60 с и происходила быстрее, чем при введении норадреналина, вызывавшего подобный эффект (рис. 1). Эффект мог быть воспроизведен повторно у того же животного. Минимальная доза, при которой наблюдался отчетливый эффект, составляла 100 мкг/кг, однако в отдельных опытах зафиксирован прирост АД в ответ на значительно меньшую дозу пептида (1–10 мкг/кг). Применение более высоких доз (до 0,6 мг/кг) сопровождается почти линейным нарастанием воздействия на АД, после чего кривая “доза–эффект” выходит на плато (рис. 2). Подобный вид имеет и кривая “доза–эффект” для ЧСС (рис. 3). Установлена очень тесная корреляция (r=0,93) между реакцией АД и ЧСС при введении различных доз пептида. При этом относительный прирост АД был примерно втрое выше, чем относительный прирост ЧСС. В одном опыте на крысе со спонтанной гипертонией (линия SHR) при исходном уровне САД 185 мм рт. ст. введение пептида (100–200 мкг/мл) также повышало АД, но в относительно меньшей степени, чем у крыс линии Wistar (до 205–206 мм рт. ст.).
   Высокая скорость развития эффекта позволила предположить участие в ней катехоламинов. Исходная концентрация катехоламинов в образцах крови, взятых перед введением пептида: норадреналин – 356±83, адреналин – 237±73, дофамин – 56±9 (все величины в пг/мл). После введения пептида уровень норадреналина возрос в 4,5 раза, адреналина – в 2 раза, а уровень дофамина остался прежним (рис. 4), однако только прирост уровня норадреналина был статистически достоверным (p<0,02). При этом отношение уровней норадреналин/адреналин в каждом опыте осталось неизменным (около 1,6).
   С помощью иммуногистохимического метода определения мест связывания нейропептида при помощи антител удалось установить, что помимо большого числа мест связывания в гипоталамусе [4] они присутствуют также в стенках сосудов различных областей мозга, причем обнаруживаются во всей толще сосуда (рис. 5). Более высокая плотность рецепторов FF1 обнаружена в более крупных сосудах, мелкие же сосуды содержали минимальное количество метки.
   Изучение распределения пептида по тканям организма было проведено с использованием меченного 99mTc модифицированного пептида. Испытание in vivo показало, что функциональный эффект его сохранялся, но был ослаблен (примерно 60% от величины эффекта нативного пептида). Введение меченого пептида 4 крысам показало его интенсивное накопление в течение 1 мин в тканях печени. Через 10 мин в печени его оставалось 42,5%, в кишечнике – 29,5%, в почках – 4,5%, в остальных органах содержание пептида не превышало 1% (сердце – 0,16%, головной мозг – 0,05%, кровь – 0,28%, мышцы – 0,29%). Дальнейшее наблюдение в течение 1 ч показало постепенное снижение содержания пептида в печени, но неуклонное повышение в кишечнике (до 70% к исходу часа).
   В опытах на изолированных полосках аорты наблюдали, как изменяется их тонус при добавлении к перфузионному раствору нейропептида в концентрациях 10-9–10-5 М. Нейропептид в указанных концентрациях не влиял ни на исходный тонус сосуда, ни на повышенный норадреналином. Аналогичный результат был получен на сосудах с удаленным эндотелием. Таким образом, в широком диапазоне концентраций нейропептид FF не влиял на тонус изолированного сосуда.   

Рис. 1. Действие нейропептида FF на САД у бодрствующей крысы в возрастающих дозах: 1 – 0,4 мг/кг, 2 – 0,6, 3 – 0,8, 4 – 1,0, 5 – 1,2 мг/кг; 6 – действие норадреналина (0,2 мг/кг). Шкала давления – в мм рт. ст., отметка времени – 3 мин.



Рис. 3. Зависимость ЧСС у бодрствующих крыс от дозы нейропептида FF (M±SEM).



Рис. 2. Зависимость САД у бодрствующих крыс от дозы нейропептида FF (M±SEM).



Рис. 4. Влияние нейропептида FF на концентрацию катехоламинов в крови (пг/мл).



Рис. 5. Поперечный срез сосуда головного мозга крысы. Стрелками показаны места локализации рецепторов FF1 в стенке сосуда. Шаблон 10 мкм.

 

Обсуждение
   
Наши результаты подтвердили данные других авторов [7–11] о наличии у нейропептида FF вазопрессорного и тахикардического эффектов. Новым в нашей работе стало наблюдение эффектов на бодрствующих животных. Хотя принципиальные характеристики (быстрое развитие и спад эффекта, преобладание прессорной реакции над тахикардической) при бодрствовании не изменились, исходный фон АД был значительно выше (118 мм рт. ст. против 90 мм рт. ст. у наркотизированных крыс). Кроме того, мы испытали более широкий диапазон доз препарата и получили кривые “доза–эффект” для АД и ЧСС, причем была установлена тесная корреляция между величинами вазопрессорного и тахикардического эффектов, что позволяет предполагать повышенную активацию симпатического отдела автономной системы.
   В отличие от М.Allard и соавт. [10], не наблюдавших изменений уровня катехоламинов в крови, в наших экспериментах зафиксировано достоверное повышение уровня норадреналина. Это различие может быть связано с состоянием бодрствования, при котором исходный уровень катехоламинов и их реакция на пептид увеличены. Ослабление вазопрессорного и тахикардического эффектов под влиянием блокады адренорецепторов, а также неизменность барорецепторного рефлекса [10] свидетельствуют о преимущественном прямом действии пептида на периферическом уровне. С этим согласуются данные о наличии мест связывания пептида в желудочках сердца [10]. Обнаружение мест связывания пептида в сосудах головного мозга [4] позволяло предполагать аналогичное явление в периферических сосудах. Однако исследование действия пептида на изолированных сосудах в нашей работе продемонстрировало отсутствие эффекта при наличии и в отсутствие эндотелия. Это не согласуется с гипотезой о прямом действии пептида на периферическом уровне. В связи с этим интересным представляется испытание пептида на изолированном сердце.
   В нашей работе также впервые прослежена судьба модифицированного пептида после реализации эффекта. Выяснилось, что он главным образом поглощается печенью, а затем выводится через кишечник. Вероятно, таким же путем выводятся из организма части нативного пептида после его разрушения в кровотоке.
   Вопрос о физиологической роли пептида по-прежнему остается открытым. Повышение уровня пептида у пациентов, подвергнутых электроимпульсной терапии [14], позволяет предполагать вовлечение пептида в реакцию мобилизации кровообращения в экстремальных ситуациях, например при внезапном обмороке, коллапсе, кардиогенном шоке. Вместе с тем очевидно, что его роль может быть лишь экстренной, пусковой, после чего должны включаться более стабильно действующие механизмы. Для выяснения его функциональной роли необходимы дальнейшие исследования на различных экспериментальных моделях. В этом плане обнаружение двух антагонистов пептида, обладающих разным эффектом [11], свидетельствует о сложной взаимосвязи между пептидом и другими регуляторами кровообращения.   

Литература
1. Panula P, Aarnisalo AA, Wasowicz K, Neuropeptide FF, a mammalian neuropeptide with multiple functions. Prog Neurobiol 1996; 48: 461–87.
2. Sundblom DM, Hyrkko A, Fyrhrquist F. Pulsatile secretion of neuropeptide FF into human blood. Peptides 1998; 19: 1165–70.
3. Kivipelto L. Ultrastructural localization of neuropeptide FF, a new neuropeptide in the brain and pituitary of rats. Regul Pept 1991; 34: 211–24.
4. Goncharuk V, Zeng Z, Wang R et al. Distribution of the neuropeptide FF1 receptor (hFF1) in the human hypothalamus and surrounding basal forebrain structures: immunohistochemical study. J Comp Neurol 2004; 474: 487–503.
5. Goncharuk VD, Buijs RM, Mactavish D, Jhamandas JH. Neuropeptide FF distribution in the human and rat forebrain: a comparative immunohistochemical study. J Comp Neurology 2006; 496: 572–93.
6. Kivipelto L, Arnisalo A, Panula P. Neuropeptide FF is colocalized with catecholamine-synthesizing enzymes in neurons of the nucleus of the solitary tract. Neurosci. Lett 1992; 143: 190–4.
7. Barnard CS, Dockray GJ. Increases in arterial blood pressure in the rat in response to a new vertebrate neuropeptide, LPLRF amide, and a related molluscan peptide, FMRFamide. Regul Pept 1984; 8: 209–15.
8. Roth B, Disimone J, Majane EA, Yang HYT. Elevation of arterial-pressure in rats by 2 new vertebrate peptides FLFQPQRF-NH2 and AGEGLSSPFWSLAAPQRF-NH2 which are immunoreactive to FMRF-NH2 antiserum. Neuropeptides 1987; 10: 37–42.
9. Thiemermann C, Al-Damluji S, Hecker Mand Vane JR. FMRF-amide and L-Arg-L-Phe increase blood pressure and heart rate in the anesthetized rat by central stimulation of the sympathetic nervous system. Biochem Biophys Res Commun 1991; 175: 318–24.
10. Allard M, Labroucha S, Nosjean A, Laguzzi R. Mechanism underlying the cardiovascular response to peripheral administration of NPFF in the rat. J Pharmacol Exp Ther 1995; 274: 577–83.
11. Prokai L, Zharikova AD, Juhasz A, Prokai-Tatrai K. Cardiovascular effects of neuropeptide FF antagonists. Peptides 2006 (Electronic publication).
12. Laguzzi R, Nosjen A, Mazarguil H, Allard M. Cardiovascular effects induced by the stimulation of neuropeptide FF receptors in the dorsal vagal complex: an autoradiographic and pharmacological study in the rat. Brain Res 1996; 711: 193–202.
13. Versteeg DG, Van Bergen P, Adan RA, De Wildt DJ. Melanocortins and cardiovascular regulation. Eur J Pharmacol 1998; 360 (1): 1–14.
14. Sundblom DM, Heikman P, Naukkarinen H, Fyhrquist F. Blood concentrations of vasopressin, neuropeptide FF and prolactin are increased by high-dose right unilateral ECT. Peptides 1999; 20: 319–26.



В начало
/media/cardio/06_02/10.shtml :: Thursday, 25-Jan-2007 20:05:13 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster