Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 01/N 2/2006 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Стрессогенная потенциация трансинтестинального антигенного транспорта как физиологическая основа развития системных и локальных воспалительных процессов


С.Ф.Дугин, Н.В.Анищенко, З.С.Агаджанян, Р.Ш.Бибилашвили, Т.Х.Гурская, Я.Г.Гурский, М.А.Звягинцева, Т.К.Люкова

Институт экспериментальной кардиологии, Москва

Цель исследования. Проверка гипотезы о роли стрессогенной потенциации трансинтестинального антигенного транспорта (ТАТ) в развитии системной воспалительной реакции.
Материал и методы. Проведено количественное исследование влияния на ТАТ острого стресса (электрокожная стимуляция, иммобилизация) и хронической патологии (тетрахлорметановый гепатоз). Флюоресцирующие бактерии и микросферы вводили внутрижелудочно и их содержание во внутренних органах определяли гистологически, микробиологически и флюориметрически.
Результаты. У крыс, подвергшихся электрокожной стимуляции, флюоресцирующие бактерии были обнаружены в пейеровых бляшках, селезенке и печени. Иммобилизация вызывала не только значительное увеличение транслокации микросфер в органы ретикулоэндотелиальной системы, но, кроме того, микросферы были выявлены в почках. Статистический анализ позволил выявить прямую зависимость между количеством микросфер в печени и уровнем С-реактивного белка в крови с коэффициентом корреляции 0,999 (p<0,01).
Заключение. Полученные результаты подтвердили исходную гипотезу о том, что стрессогенные воздействия сопровождаются выраженной активацией ТАТ и развитием системной воспалительной реакции, а также миграцией микросфер в почки.
Ключевые слова: Трансинтестинальный антигенный транспорт, бактерии, флюоресцентные микросферы, электрокожная стимуляция, иммобилизация, тетрохлорметановый гепатоз, С-реактивный белок.


S.F. Dugin, N.V. Anishchenko, Z.S. Agadzhanyan, R.Sh. Bibilashvili, T.Kh. Gurskaya, Ya.G. Gursky, M.A. Zvyagintseva, T.K. Lyukova
Institute of Experimental Cardiology, Moscow

Stress-induced transintestinal antigenic transport potentiation as
the physiological basis for the development of systemic and local
inflammatory processes


Aim. To the hypothesis that stress-induced potentiation of transintestinal antigenic transport (TAT) plays a role in the development of a systemic inflammatory reaction.
Materials and methods. Acute stress (electrodermal stimulation, immobilization) and chronic disease (tetrachloromethane hepatosis) were estimated for impact on TAT. Fluorescent bacteria and microspheres were intragastrically administered and their visceral content was determined histologically, microbiologically, and fluorimetrically.
Results. In the rats exposed to electrodermal stimulation, fluorescent bacteria were detected in Peyer’s plaques, spleen, and liver. Immobilization caused not only a significant increase in the translocation of microspheres into the reticuloendothelial organs, but the microspheres were also found in the kidneys. Statistical analysis established a direct correlation between the number of hepatic miscrospheres and the blood level of C-reactive protein with a correlation coefficient of 0.999 (p<0.01).
Conclusion. The findings have validated the hypothesis that stressor effects are accompanied by the pronounced activation of TAT, the development of a systemic inflammatory reaction, and the migration of microspheres into the kidneys.
Key words: transintestinal antigenic transport (TAT), bacteria, fluorescent microspheres, electrodermal stimulation, immobilization, tetrachloromethane hepatosis, C-reactive protein.

Микробы и их токсины проникают в ткани и кровь не посредством шприца или другого инструмента. Они должны сами проложить себе путь сквозь кожу и слизистые оболочки…

И.И.Мечников

  Хотя ведущая роль воспаления в развитии атеросклероза [1] и других сердечно-сосудистых заболеваний является общепризнанной, однако природа ключевых процессов инициации воспалительных процессов остается неизвестной, в частности это касается механизмов повышения содержания в крови такого прогностически важного фактора, как С-реактивный белок (СРБ) [2]. Согласно современным представлениям активация синтеза СРБ гепатоцитами обусловлена действием интерлейкина-6, секретируемого купферовскими клетками в ответ на действие бактериальных эндотоксинов при развитии инфекционного процесса. Однако причины умеренного повышения концентрации СРБ у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями при отсутствии острой инфекции или травмы не установлены.
   В большинстве экспериментальных исследований для активации синтеза белков острой фазы используют искусственное введение различных соединений бактериальной природы (липополисахариды, пептидогликаны, ДНК), однако, как отмечал Н.Н.Аничков, полученные таким способом результаты не позволяют выяснить то, "каким образом и при каких условиях на самом деле происходит проникновение микробов в организм и их дальнейшее распространение в нем…" [3]. Традиционно считается, что острый стресс оказывает иммуномодулирующее действие (реципрокность взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем), в частности, обусловленное противовоспалительным действием глюкокортикоидов. Однако в конце XX века было показано, что влияние стресса на иммунную систему носит более сложный характер и необходимо учитывать участие в стрессогенной реакции желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) с находящимися в нем бактериями [4]. В частности, Т.Deak и соавт. показали провоспалительный эффект умеренного острого стресса – через 24 ч после электрокожной стимуляции у крыс происходило значительное повышение содержания в крови гаптоглобина – одного из белков острой фазы [5]. Авторы не нашли объяснения этому факту. С нашей точки зрения, возможный механизм связан со стрессогенной потенциацией бактериальной транслокации (БТ) – переходом бактерий из кишечника во внутреннюю среду [4]. Экспериментально было показано, что БТ может выявляться не только при шокогенных воздействиях [4], но и при действии умеренного стресса [6, 7]. После 4-часовой иммобилизации живые кишечные бактерии были выявлены у мышей в брыжеечных узлах, селезенке и печени [7]. В середине 90-х годов XX века был выяснен основной клеточный механизм БТ – трансцитоз бактерий специализированными М-клетками кишечного эпителия [8]. Особенностью М-клеток является то, что они захватывают и транспортируют к лимфоидной ткани из просвета кишки различные антигены (бактерии, микрочастицы) – выполняют функцию трансинтестинального антигенного транспорта (ТАТ). Остается открытым вопрос о функциональном значении ТАТ.
   Целью данной работы была проверка гипотезы о роли стрессогенной потенциации ТАТ в развитии системной воспалительной реакции.   

Материал и методы
   
Для качественной оценки функции ТАТ у крыс линии Спрэйг-Доули использовали бактерии E. сoli, синтезирующие зеленый флюоресцирующий белок (ЗФБ). В данной работе использовали штамм Е. сoli K-12 JM109. Клетки E. сoli K-12 JM109 трансформировались последовательно двумя плазмидами: p1588 (имеющей p15A репликон и сообщающей бактериям устойчивость к канамицину и несущей ген tRNA4Arg) и p802 (имеющей pTZ-версию репликона ColEI, сообщающей бактериям устойчивость к ампицилину и кодирующей белок ЗФБ. Плазмида р802 представляет собой вектор pTZ19, содержащий кодирующую ЗФБ-вставку из плазмиды pGFP (BD Clontech, США). Интрагастрально крысам вводили 1 мл жидкой питательной среды с E. сoli K-12 JM109 в дозе 1 ґ 108 бактерий/мл. Для вызова стрессогенной БТ проводили сверхпороговую электрокожную стимуляцию находящихся в камере крыс в течение 1 ч по 5 с (40 вольт) с интервалом в 30 с. Шесть крыс (опыт) подвергли электрокожной стимуляции. Четырех крыс (контроль) не подвергали каким-либо воздействиям. Через 24 ч крыс декапитировали. Производили взятие пейеровых бляшек, брыжеечных лимфатических узлов (БЛУ) и ткани печени, которые анализировали гистологически и бактериологически. Из гомогенатов органов производили посевы на питательную среду, содержащую ампицилин, канамицин, и инкубировали в термостате при 37оС в течение 24 ч.
   Для количественной характеристики процесса ТАТ у крыс нами были использованы флюоресцентные микросферы [9]. Преимуществом их использования является отсутствие деградации в организме, что позволяет визуализировать микросферы во внутренних органах. За 0,5 ч до иммобилизации крысам внутрижелудочно вводили флюоресцентные микросферы (Carboxyate BB 1,75 micron Microspheres. Polysciens, Inc.) в дозе 1 ґ 109 частиц. Через 24 ч крыс декапитировали.
   В третьей серии экспериментов изучали влияние иммобилизационного стресса на ТАТ у крыс на фоне гепатита. Модель гепатита воспроизводили путем 5-кратного в течение 10 дней перорального введения тетрахлорметана в виде 50% раствора в оливковом масле в дозе 1000 мг/100 г массы тела крысы. Тетрахлорметан вводили в 16-00 ч на пике активности микросомального цитохрома. Контрольную группу составляли животные, которые получали эквивалентное количество оливкового масла. На 10-й день эксперимента внутрижелудочно вводили флюоресцентные микросферы в дозе 1 ґ 109 частиц. Через 24 ч крыс декапитировали. Кровь центрифугировали при 5000 g 10 мин при 4оC для получения сыворотки, которую использовали для определения активности печеночных ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, гамма-глутамиламинотрансферазы и содержания билирубина с помощью наборов "Pliva-Lachema" на спектрофотометре Hitachi 557.
   У крыс после декапитации выделяли брыжеечные лимфатические узлы, селезенку, печень, почки и легкие. Органы гидролизовали с помощью 4 N водного раствора калия гидроксида в течение 48 ч. На поверхность раствора наносили 1,5 мл изопропанола. По окончании процедуры гидролизованную смесь центрифугировали (10000 g/10 мин). Осадок (микросферы) дважды промывали фосфатным буфером рН 7,4, с последующим центрифугированием (10000 g/10 мин). Флюоресцентную метку экстрагировали при помощи Cellosove (2-Ethoxyethanol) (Aldrich, ФРГ) [10]. В экстракте методом добавок определяли уровень флюоресценции, используя флуориметр Hitachi 557 ( l ex=320 нм, l em=415 нм). В качестве добавок использовали раствор Cellosove с известной концентрацией флюоресцентной метки.
   Для оценки состояния иммунной системы определяли концентрацию СРБ и ревматоидного фактора (РФ) в сыворотке крови методом латекс-агглютинации [11] при помощи коммерческих наборов ("Имтек", Россия).
   Исследование гистологических срезов органов (6 мкм) проводили на микроскопе "ZEISS" AXIOVERT 200 M, со стандартным набором светофильтров, регистрация изображения программой Axio Vision 3,1.
   Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи компьютерной программы BioStat по U-критерию Манна–Уитни; различия считались достоверными при p<0,05. При множественных сравнениях учитывали корректировку Бонферрони. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (M±m).

Таблица 1. Содержание микросфер во внутренних органах крыс

Группы животных

Органы, количество микросфер 1ґ105 частиц на 1 г ткани

БЛУ печень селезенка почки
Контроль (n=10) 1,9±0,2 0,1±0,03 0,2±0,04 0
Иммобилизация (n=10) 3,5±0,6* 1,2±0,2* 0,72±0,07* 0,19±0,02*
Гепатит (n=10) 4,1±0,4* 1,9±0,4* 0,81±0,05* 0,26±0,04*
Гепатит + иммобилизация (n=10) 4,9±0,8* 2,4±0,2* 0,86±0,05* 0,45±0,08*
* – p<0,05 относительно контроля.

Таблица 2. Уровень СРБ и РФ в сыворотке крови крыс

Группы животных

Показатель

СРБ (мкг/мл) РФ (МЕ/мл)
Контроль (n=10) 0,5±0,02 0,9±0,05
Иммобилизация (n=10) 3,3±0,05* 3,1±0,07*
Гепатит (n=10) 5,6±0,03* 5,1±0,05*
Гепатит + иммобилизация (n=10) 7,0±0,05* 6,2±0,09*
* – p<0,05 относительно контроля.

Рис. 1.Флюоресцентная микроскопия гистологических срезов печени контрольного (а) и стрессированного (б) животного. Стрелками обозначены флюоресцирующие E. coli K-12 JM109.

Рис. 2. Флюоресцентная микроскопия гистологического среза печени крысы. Стрелки указывают на флюоресцентные микросферы.

Рис. 3. Флюоресцентная микроскопия гистологического среза почки крысы. Стрелки указывают на флюоресцентные микросферы.

   

Результаты
   
В первой серии экспериментов была проведена проверка нашего предположения о возможной роли стрессогенной БТ в развитии системной воспалительной реакции на кратковременную ноцицептивную стимуляцию, выявленную в работе Т.Deak и соавт. [5]. Крысам за полчаса до стрессогенного воздействия внутрижелудочно вводили синтезирующие ЗФБ бактерии, которые через сутки были выявлены у 5 из 6 крыс в лимфатических узлах, что подтвердило наше предположение. Кроме того, гистологически бактерии были выявлены в печени стрессированных крыс (рис.1).
   Во второй серии экспериментов изучали возможную роль стрессогенной активации ТАТ в развитии системных и локальных воспалительных реакций с использованием флюоресцентных микросфер (табл. 1). Иммобилизация вызывала значительное увеличение транслокации микросфер в органы ретикулоэндотелиальной системы, наибольший прирост был выявлен в печени (рис. 2), кроме того, микросферы были выявлены в почках (рис. 3). Уровени СРБ и РФ в плазме крови повысились в ответ на иммобилизацию, а также при экспериментальном гепатите (табл. 2).
   Хроническое введение тетрахлорметана вызывало повреждение печени, о чем свидетельствовало достоверное увеличение (в 3–8 раз) в сыворотке крови активности печеночных ферментов и повышение содержания билирубина в сыворотке крови в 1,5 раза (относительно показателей контрольной группы). У крыс с гепатитом выявлено значительное увеличение количества флюоресцентных микросфер в органах (см. табл. 1) при сравнении с органами контрольной группы. Иммобилизация на фоне гепатита вызывала дополнительное повышение количества микросфер во внутренних органах крыс (см. табл. 1), а также уровней СРБ и РФ в сыворотке их крови (см. табл. 2). Статистический анализ позволил выявить прямую зависимость между количеством микросфер в печени и уровнем СРБ в крови с коэффициентом корреляции 0,999 (p<0,01).   

Обсуждение
   
Полученные результаты подтверждают обоснованность высказанной нами гипотезы о роли стрессогенной активации ТАТ в запуске системных и локальных воспалительных процессов. Механизм стрессогенного запуска синтеза белков острой фазы гепатоцитами можно представить следующим образом: любой стрессогенный фактор (психологический, физический) вызывает активацию ТАТ, что увеличивает поступление в организм бактерий из кишечника (эндигенных в случае дисбактериоза или экзогенных в случае контаминации пищи или воды) – бактерии из лимфатических узлов попадают в ретикулоэндотелиальную систему, что приводит к активации синтеза интерлейкина-6 купферовскими клетками, который в свою очередь активирует экспрессию белков острой фазы гепатоцитами. Наличие активации ТАТ у крыс с локальными воспалительными процессами – гепатитом, а также с адъювантным артритом (по нашим предварительным результатам, у них транслокация микросфер в печень увеличена более чем в 100 раз) при пропорциональном повышении содержания СРБ в крови, показывает, что такой механизм активации синтеза печеночных маркеров воспаления носит общий характер.
   На рис. 2 и 3 приведены гистологические доказательства миграции перорально введенных микросфер соответственно в печень и почки крыс после иммобилизационного стресса. Наличие микросфер за пределами ретикулоэндотелиальной системы показывает возможный механизм развития локальных воспалительных процессов, обусловленных миграцией бактерий из ЖКТ, например в случае бактериальной контаминации питьевой воды, приводящей к развитию у людей дисфункции почек (микроальбуминурия) и артериальной гипертонии [12]. Поскольку микросферы не обладают какими-то биологическими свойствами для преодоления гистогематических барьеров, то эти результаты убедительно доказывают, что ведущую роль в распространении кишечных антигенов играют эндогенные механизмы, на что указывал еще И.И.Мечников: "…(фагоциты) выполняют иногда вынужденную роль распространителя заразы по телу" [13]. Изучение механизмов такой инверсии иммунных функций является в настоящее время одной из важнейших задач биомедицинских исследований, решение которой позволит понять патогенез таких заболеваний, как инфекционный эндокардит и бактериальный пиелонефрит.   

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№05-04-49844) и Президента РФ (№НШ-8521.2006.7).

Литература
1. Ross R. Atherosclerosis – an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340 (2): 115–26.
2. Kushner I, Rzewnicki D, Samols D. What does minor elevation of C-reactive protein signify? Am J Med 2006; 119 (2): 166.e17–28.
3. Аничков Н.Н. Об одном новом направлении экспериментальных исследований в области инфекционной патологии. Арх. пат. биол. наук. 1937; 45 (2): 45–52.
4. Deitch EA, Bridges RM. Effect of stress and trauma on bacterial translocation from the gut. J Surg Res 1987; 42 (5): 536–42.
5. Deak T, Meriwether JL, Fleshner M et al. Evidence that brief stress may induce the acute phase response in rats. Am J Physiol 1997; 273 (6): R1998–2004.
6. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Журлов О.С., Чертков К.Л. Свойства эшерихий, выделенных из организма мь
ґшей, при бактериальной транслокации после иммобилизационного стресса. Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол. 2000; 1: 37–41.
7. Ando T, Brown RF, Berg RD, Dunn AJ. Bacterial translocation can increase plasma corticosterone and brain catecholamine and indoleamine metabolism. Am J Physiol 2000; 279 (6): R2164–72.
8. Neutra MR. Role of M cells in transepithelial transport of antigens and pathogens to the mucosal immune system. Am J Physiol 1998; 274 (5): G785–91.
9. Ebel JP. A method for quantifying particle absorption from the small intestine of the mouse. Pharm Res 1990; 7 (8): 848–51.
10. Raab S, Thein E, Harris AG, Messmer K. A new sample-processing unit for the fluorescent microsphere method. Am J Physiol 1999; 276 (5): H1801–6.
11. Рулева Н.Ю., Люкова Т.К., Тарабарко Н.В. и др. Структура С-реактивного белка, экскретированного в мочу при ранних кризах отторжения. Бюлл. экспер. биол. мед. 2003; 135 (3): 291–3.
12. Garg AX, Moist L, Matsell D et al. Risk of hypertension and reduced kidney function after acute gastroenteritis from bacteria-contaminated drinking water. CMA J 2005; 173 (3): 261–8.
13. Мечников И.И. Невосприимчивость в инфекционных болезнях. Академ. собр. соч. М., 1953; 8: 349.



В начало
/media/cardio/06_02/21.shtml :: Thursday, 25-Jan-2007 20:06:09 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster