Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 01/N 2/2006 ЛЕКЦИЯ

Роль киназы легких цепей миозина в барьерной функции эндотелия и перспективы использования ее ингибиторов при нарушениях сосудистой проницаемости


В.П.Ширинский

Институт экспериментальной кардиологии, Москва

Проницаемость сосудистой стенки определяется состоянием эндотелиального монослоя и может значительно возрастать при различных патологических состояниях, приводя к развитию отека и повреждению органов и тканей. Нарушение барьерной функции эндотелия в стрессорных ситуациях происходит за счет сокращения клеток и появления межклеточных щелей, сквозь которые свободно проходят молекулы любого размера. Сокращение эндотелиальных клеток опосредуется актомиозином и активируется киназой легких цепей миозина (КЛЦМ). Фармакологическое ингибирование активности этого фермента в экспериментальных условиях или его генетическая инактивация у мышей приводит к усилению барьерной функции сосудистого эндотелия и защищает органы от повреждения. Эти данные позволяют рассматривать КЛЦМ как перспективную молекулярную мишень для разработки новых лекарственных веществ – регуляторов сосудистой проницаемости, которые могут применяться в кардиологии и других областях медицины для коррекции эндотелиальной дисфункции.

V.P. Shirinsky
Institute of Experimental Cardiology, Moscow

The role of light-chain myosin kinase in endothelial barrier functions
and the prospects for use of its inhibitors in impaired vascular permeability


Vascular wall permeability is determined by the state of the endothelial monolayer and it can significantly increase in different abnormalities, resulting in the development of edema and damage to viscera and tissues. Under stresses, endothelial barrier function in impaired due to the shortening of cells and the emergence of intercellular slits through which molecules of any size freely pass. The shortening of endothelial cells is mediated by actomyosin and activated by light-chain myosin kinase (LCMK). The drug-induced activity of this enzyme under experimental conditions or its genetic inactivation in mice leads to enhanced vascular endothelial barrier function and protects viscera from damage. The findings suggest that LCMK can be regarded as a promising molecular target for designing the new drugs – vascular permeability regulators that may be used in cardiology and other fields of medicine for the correction of endothelial dysfunction.

   Развитие атеросклероза и его осложнений, таких как ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, мозговой инсульт, ремоделирование сердца и сосудов, сердечная недостаточность, образуют последовательность событий, объединяемых понятием "сердечно-сосудистый континуум" (ССК). Ряд факторов и заболеваний, включающих артериальную гипертонию, нарушения липидного и углеводного обмена, курение, способствуют возникновению ССК. Воздействие факторов риска на развитие ССК может осуществляться при участии различных механизмов. Одним из наиболее важных из них считается дисфункция эндотелия, которая определяется как нарушение барьерных свойств эндотелия, потеря им способности регулировать тонус и толщину сосуда, управлять процессами коагуляции и фибринолиза, оказывать иммунное и противовоспалительное действие. В обзоре основное внимание уделено молекулярным механизмам регуляции барьерной функции эндотелия и перспективам ее фармакологической коррекции при патологических состояниях.   

Механизмы эндотелиального транспорта
   
Эндотелиальный монослой на внутренней поверхности кровеносных сосудов служит полупроницаемым барьером на пути перемещения питательных веществ, сигнальных молекул и клеток иммунной системы из крови в ткань. Известно два основных пути транспорта веществ через эндотелий – сквозь тело эндотелиальной клетки (трансэндотелиальный транспорт) и между клетками (парацеллюлярный транспорт) [1]. Принято считать, что в нормальных условиях крупные молекулы, такие как альбумин, иммуноглобулины и другие белки, поступают в ткань путем активного переноса через цитоплазму эндотелия в кавеолярных пузырьках. Низкомолекулярные соединения (глюкоза, мочевина, вода и др.) могут проходить в зазоры между эндотелиальными клетками. В то же время до 40% транспорта воды происходит трансцеллюлярно с помощью белков аквапоринов (рис. 1). Кавеолярный транспорт может вносить дополнительный вклад в перемещение малых молекул вместе с белками. Показано, что кавеолы могут сливаться между собой и образовывать подобие пор, через которые сквозь тело эндотелиальной клетки могут транспортироваться молекулы разного размера. При воздействии на эндотелий тромбина, бактериального эндотоксина, активных форм кислорода (АФК) и при других стрессорных состояниях развивается сокращение клеток. В этот процесс вовлечена киназа легких цепей миозина (КЛЦМ), как непосредственный активатор молекулярного мотора миозина (см. рис. 1). Сокращение эндотелия разрушает межклеточные контакты и приводит к резкому повышению проницаемости монослоя и потере его селективности. В результате развивается отек ткани. Уровень проницаемости эндотелиального монослоя определяется балансом адгезивных взаимодействий и сократительного статуса клеток. Экстравазация лейкоцитов происходит в основном сквозь межклеточные контакты эндотелиального монослоя. В зависимости от локализации эндотелия в сосудистой системе плотность межклеточных контактов варьирует. Наиболее проницаемым является эндотелий капилляров и венул, наименее проницаем эндотелий артерий.   

Молекулярная организация эндотелиальных контактов
   
Ультраструктурно соединения эндотелиальных клеток образованы плотными контактами, в которых мембраны соседних клеток практически сливаются между собой, а также адгезивными контактами, имеющими больший зазор (см. рис. 1). Щелевые контакты между эндотелиальными клетками, служат не столько для создания барьера, сколько для коммуникации между клетками в монослое. Щелевые контакты образованы белками коннексинами, формирующими поры, через которые соседние эндотелиальные клетки могут обмениваться сигнальными молекулами (Са2+, цАМФ, инозитолтрисфосфатом и др.). Помимо связи друг с другом клетки эндотелия прикрепляются к базальной мембране, которая состоит из белков внеклеточного матрикса, секретированных самими эндотелиальными клетками. Основными компонентами матрикса являются ламинин, коллагены, фибронектин, витронектин и протеогликаны.
   На молекулярном уровне взаимодействие эндотелиальных клеток между собой и с внеклеточным матриксом осуществляется специальными трансмембранными белками (окклюдинами, кадгеринами, интегринами и др.). Важным и общим свойством этих макромолекул является то, что их цитоплазматические домены взаимодействуют с различными регуляторными и адапторными белками, которые обеспечивают их связь с цитоскелетом и сократительным аппаратом клетки. За счет такой организации контакты, с одной стороны, становятся важным звеном в цепи проведения механических сигналов внутрь клетки, с другой – клетка получает возможность управлять состоянием контактов. Таким образом, проницаемость монослоя есть результат противодействия адгезивных и сократительных сил, создаваемых эндотелием в ответ на внешние стимулы.   

Модуляторы эндотелиальных контактов
   
К агентам, вызывающим повышение проницаемости сосудистого эндотелия, относятся тромбин, гистамин, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), брадикинин, бактериальный эндотоксин, фактор некроза опухоли, активные формы кислорода, избыточная механическая деформация. Укрепление эндотелиального барьера вызывают сфингозин-1-фосфат и ангиопоэтин-1, некоторые формы окисленных фосфолипидов, и этот список продолжает расти. Перечисленные вещества действуют в разных патофизиологических контекстах и по разным механизмам, но приводят к единому результату – модуляции барьерной функции эндотелия сосудов за счет изменения контактных взаимодействий эндотелиальных клеток. Несостоятельность межклеточных контактов эндотелиоцитов при сепсисе, ишемии, травмах, токсемии, аллергических состояниях приводит к генерализованному отеку и повреждению легких, сердца, мозга и других органов и тканей и к развитию вторичных воспалительных процессов. В то же время само воспаление как защитная реакция организма включает в себя компонент локального повышения проницаемости микрососудов с целью ликвидации причины воспаления.   

Регуляция сократительной активности эндотелия. Роль КЛЦМ
   
Сокращение эндотелиальных клеток в монослое с образованием межклеточных щелей и повышением проницаемости происходит с помощью тех же механизмов, что и мышечное сокращение, а именно за счет скольжения миозиновых и актиновых филаментов относительно друг друга [2]. Для того чтобы немышечный миозин эндотелиальных клеток образовал филаменты и смог развивать сократительное усилие, его регуляторные легкие цепи (РЛЦ) должны быть фосфорилированы. Эта реакция осуществляется КЛЦМ и другими протеинкиназами со сходной специфичностью. Помимо стимуляции филаментообразования фосфорилирование РЛЦ активирует моторный домен миозина. Таким образом, фосфорилирование единственного аминокислотного остатка (Сер19) на молекуле миозина запускает сокращение клеток эндотелия. Антагонистом КЛЦМ выступает фосфатаза легких цепей миозина, которая дефосфорилирует РЛЦ и, таким образом, способствует расслаблению эндотелиальных клеток и восстановлению непрерывности монослоя.
   КЛЦМ является ферментом, зависимым от Са2+-кальмодулина, и активируется при повышении содержания свободного Са2+ в цитоплазме эндотелиальной клетки при ее стимуляции мобилизующими Са2+-агонистами – тромбином, гистамином, VEGF, гемодинамическими воздействиями (напряжением сдвига на поверхности эндотелия и растяжением сосудистой стенки), а также активными формами кислорода. Другой протеинкиназой, вовлеченной в регуляцию сократимости эндотелия, считается Rho-киназа, которая активируется малой ГТФазой RhoA в ответ на стимуляцию эндотелия тромбином и другими агонистами. Согласно данным, полученным на неэндотелиальных клетках, КЛЦМ и Rho-киназа имеют различные, хотя и перекрывающиеся "зоны ответственности". Rho-киназа фосфорилирует миозин в окоядерной области клетки, тогда как КЛЦМ активирует миозин в периферической кортикальной цитоплазме [3]. Именно в этой области расположены межэндотелиальные контакты, и экспериментальные данные указывают на то, что КЛЦМ вовлечена в регуляцию их динамики. Так, ингибирование каталитической активности КЛЦМ повышало барьерные свойства эндотелия в культуре, а введение в эндотелиальные клетки конститутивно активной КЛЦМ, наоборот, увеличивало проницаемость эндотелиального монослоя [4, 5]. Аналогично, ингибирование КЛЦМ и кальмодулина в перфузируемом легком снижало капиллярную фильтрацию, вызванную гипервентиляцией [6]. Наиболее прямое доказательство участия КЛЦМ в сосудистой проницаемости достигнуто в результате получения линии мышей с генетическим нокаутом эндотелиальной изоформы КЛЦМ (КЛЦМ210) [7]. Эти животные демонстрировали устойчивость к повреждению легких в модели сепсиса и искусственной вентиляции легких. При гистологическом исследовании у них отсутствовал геморрагический экссудат в альвеолах и признаки интерстициального отека, что свидетельствовало о сниженной проницаемости микрососудов легких. В тех же условиях у контрольных животных развивалось массированное поражение легких, завершавшееся 100% летальным исходом в течение первых 20 мин вентиляции. За этот период времени все нокаутные мыши выживали, а летальность после часовой вентиляции составляла 40%. Однократное введение диким мышам ингибитора КЛЦМ значительно ослабляло повреждение легких бактериальным эндотоксином и механическим растяжением и снижало летальность до 40%, как и в группе нокаутных животных. Таким образом, с помощью методов молекулярной генетики и химической биологии была убедительно показана роль КЛЦМ как регулятора сосудистой проницаемости в стрессорных состояниях.

Рис. 1. Контактные взаимодействия и сократимость эндотелиальных клеток регулируют проницаемость сосудистой стенки.
Эндотелиальные клетки соединены друг с другом посредством плотных контактов (1), щелевых контактов (2) и адгезивных контактов (3), а также прикреплены к внеклеточному матриксу с помощью фокальных контактов, содержащих белки-интегрины. Эндотелиальные контакты связаны с сократительным аппаратом клетки, состоящим из актина и миозина. VEGF – фактор роста сосудистого эндотелия. Тонкими красными стрелками показано направление сокращения актомиозиновых волокон, приводящее к дестабилизации межклеточных контактов.



Рис. 2. Генетический нокаут КЛЦМ210 сопровождается усилением барьерных свойств эндотелия.
Культивируемый эндотелий из микрососудов легких мыши с генетическим нокаутом КЛЦМ210 образует монослой (а) и активно захватывает флюоресцентно меченные ацетилированные липопротеиды низкой плотности, DIL (б), что свидетельствует о полноценности этих клеток; в – иммунофлюоресцентная локализация КЛЦМ210 в эндотелии микрососудов легкого мыши дикого типа с помощью специфических антител. КЛЦМ210 располагается в виде фибриллярных структур в основном вдоль границ клеток (отмечено стрелками). Двойная стрелка показывает зону расхождения мембран соседних клеток с образованием зазора между ними. Ядра клеток окрашены DAPI (серо-голубые), желто-красное окрашивание около ядер – DIL.; г – различия в проницаемости эндотелия мышей без КЛЦМ210 и эндотелия мышей дикого типа выявляются при стимуляции клеток тромбином и измерении электрического сопротивления монослоя. Контрольный эндотелий сокращается и сопротивление монослоя падает. Эндотелий мышей без КЛЦМ210 сохраняет барьерную функцию. Ув. х100 (а,б), х1000 (в).



   Исследования, выполненные нами в лаборатории клеточной подвижности РКНПК на эндотелиальных клетках микрососудов из легких мышей с нокаутом КЛЦМ210, показали, что этот белковый регулятор, в норме локализующийся в примембранном пространстве эндотелиальных клеток, отсутствует в эндотелии нокаутных животных, в то время как по другим параметрам (образование монослоя, экспрессия CD31 – PECAM-1; CD105 – эндоглина, фактора фон Виллебранда, накоплению ацетилированных липропотеидов низкой плотности) эти клетки не отличались от контрольных (рис. 2). При сравнении проницаемости нормального легочного эндотелия и эндотелия с нокаутом КЛЦМ210 методом измерения трансэндотелиального электрического сопротивления было установлено, что нокаутные клетки практически не снижали своей барьерной функции при стимуляции тромбином. Эти эксперименты прямо показали, что высокая устойчивость легких мышей с нокаутом КЛЦМ210 связана с клетками эндотелия, их замедленной или отсутствующей реакцией раскрытия межклеточных контактов при стимуляции агонистами, вызывающими резкое повышение сосудистой проницаемости.   

Перспективы применения ингибиторов КЛЦМ в медицине.
   
В совокупности накопленные данные обосновывают выбор КЛЦМ в качестве молекулярной мишени при создании нового класса лекарственных веществ – ингибиторов КЛЦМ, предназначенных для коррекции гиперпроницаемости сосудов. Спектр приложения такой химиотерапии может быть достаточно широк и включать защиту органов и тканей при сепсисе, травматических отеках, коматозных состояниях, анафилактическом шоке и менее тяжелых аллергических реакциях. В кардиологии ингибиторы КЛЦМ могут найти применение в качестве дополнительных кардиопротективных агентов при операциях на сердце. Известно, что реперфузия миокарда сопровождается распространением токсических продуктов клеточного метаболизма из области ишемии и расширением зоны повреждения сердца, что напрямую связано с нарушением проницаемости коронарных сосудов. Предварительная инфузия ингибиторов КЛЦМ может временно снизить сократительную функцию коронарного эндотелия и сделать сердце менее чувствительным к негативным эффектам, сопровождающим восстановление кровотока. Насколько успешным окажется такой подход покажут исследования, которые в настоящее время проводятся в РКНПК.
   Несмотря на то что ингибиторы КЛЦМ давно используют в экспериментальных исследованиях, их применение в медицинской практике еще не началось. Отчасти это связано с токсичностью имеющихся ингибиторов и проблемами их доставки. Помимо этого возникает вопрос о специфичности их действия, поскольку КЛЦМ присутствует во всех клетках организма и ее тотальное ингибирование представляется нежелательным.
   В последние годы начата разработка новых классов веществ – антагонистов КЛЦМ, основанных на фармакологически предпочтительных химических субстанциях и обладающих биодоступностью, т.е. проникающих в клетки и ткани. Одним из потенциальных лекарственных препаратов является ингибитор КЛЦМ на основе 3-аминопиридазинового ядра, который был с успехом применен в описанной выше работе M.S.Wainwright и соавт. [7] для защиты легких мышей от повреждения эндотоксином и принудительной вентиляцией.
   Другой перспективный ингибитор КЛЦМ пептидной природы создан на основе аутоингибиторной последовательности этого белка, которая закрывает активный центр КЛЦМ в отсутствие Са2+-кальмодулина и не позволяет ферменту фосфорилировать РЛЦ миозина [8]. Исследователи ввели в структуру пептида дополнительные лизины и аргинины, и пептид (RKKYKYRRK) приобрел трансдуцирующие свойства, т.е. способность проходить сквозь плазматическую мембрану внутрь клетки. Этим свойством обладают некоторые белковые домены и пептиды с высоким содержанием основных аминокислот, однако молекулярный механизм белковой трансдукции остается невыясненным. Общим недостатком пептидных ингибиторов является их низкая устойчивость к протеолитической деградации. Для его преодоления в пептиды вводят защитные группы или синтезируют их из D-аминокислот. В случае пептида RKKYKYRRK такая модификация увеличила время его полураспада в тысячу раз без заметной потери ингибиторных свойств.
   Избирательность действия ингибиторов КЛЦМ на эндотелий сосудов может достигаться дозированием препарата и его введением непосредственно в кровоток. При этом эндотелий окажется первой клеточной мишенью ингибитора, а произведенный им эффект снижения сосудистой проницаемости создаст дополнительный барьер для проникновения вещества за пределы стенки сосуда. Кроме того, содержание КЛЦМ210 в эндотелии значительно ниже, чем содержание КЛЦМ в гладкомышечных клетках сосудов, и при правильно подобранных дозах не должно происходить нарушение сосудодвигательных реакций. В пределах эндотелия ингибиторы КЛЦМ должны оказывать направленное воздействие только на сократительную активность клетки, поскольку у этого фермента известен лишь один естественный субстрат – молекулярный мотор миозин. Конечно, нельзя однозначно исключить взаимодействия этих соединений и с другими компонентами клеток, что должно быть проверено на экспериментальных моделях. Возможно, в ряде случаев избирательное ингибирование КЛЦМ210 в эндотелии для снижения сосудистой гиперпроницаемости может оказаться более предпочтительным, чем фармакологические вмешательства в цитокин-хемокиновые каскады, систему комплемента и т.д., что влияет на иммунный статус пациента.
   Разумеется, будущее внесет свои коррективы в намеченные перспективы использования антагонистов КЛЦМ в медицине, однако уже сейчас очевидно, что современная фармакология входит в эру создания принципиально новых препаратов – модуляторов протеинкиназ. Являясь продуктом высоких молекулярно-генетических и химических технологий, они позволят перевести процесс лечения пациента на качественно новый уровень.   

Работа поддержана грантами РФФИ,
HHMI и CRDF (RU-B1-2576-MO-04).

Автор благодарен проф. Д.М.Ваттерсону (Северо-Западный Университет, Чикаго, США) за любезно предоставленных мышей с генетическим нокаутом КЛЦМ210, проф. Ч.Тируппати (Университет штата Иллинойс, Чикаго, США) за участие в экспериментах по измерению трансэндотелиального сопротивления и Т.Г.Куликовой за помощь в работе над рукописью.

Литература:
1. Mehta D, Malik AB. Signaling mechanisms regulating endothelial permeability. Physiol Rev 2006; 86: 279–367.
2. Ширинский В.П., Воротников А.В. Клеточная подвижность в сердечно-сосудистой системе. Природа. 2005; 12: 39–44.
3. Totsukawa G, Wu Y, Sasaki Y et al. Distinct roles of MLCK and ROCK in the regulation of membrane protrusions and focal adhesion dynamics during cell migration of fibroblasts. J Cell Biol 2004; 164: 427–39.
4. Garcia JG, Davis HW, Patterson CE. Regulation of endothelial cell gap formation and barrier dysfunction: role of myosin light chain phosphorylation. J Cell Physiol 1995; 163: 510–22.
5. Tinsley JH, De Lanerolle P, Wilson E et al. Myosin light chain kinase transference induces myosin light chain activation and endothelial hyperpermeability. Am J Physiol Cell Physiol 2000; 279: 1285–9.
6. Parker JC. Inhibitors of myosin light chain kinase and phosphodiesterase reduce ventilator-induced lung injury. J Appl Physiol 2000; 89: 2241–8.
7. Wainwright MS, Rossi J, Schavocky J et al. Protein kinase involved in lung injury susceptibility: evidence from enzyme isoform genetic knockout and in vivo inhibitor treatment. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 6233–8.
8. Owens SE, Graham WV, Siccardi D et al. A strategy to identify stable membrane-permeant peptide inhibitors of myosin light chain kinase. Pharm Res 2005; 22: 703–9.



В начало
/media/cardio/06_02/39.shtml :: Thursday, 25-Jan-2007 20:07:17 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster