Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 02/N 1/2007 ОБЗОР

Сосудистая стенка: оксидативное поражение и внеклеточная защита антиоксидантными ферментами


А.В.Ваваев, Е.Г.Тищенко, Л.И.Бурячковская, В.Л.Голубых, А.В.Максименко

Институт экспериментальной кардиологии, Москва

Активные формы кислорода оказывают повреждающее действие на всех стадиях развития сердечно-сосудистой патологии. Оксидативный стресс способствует атерогенной модификации липопротеинов низкой плотности и появлению на люминальной поверхности сосудов липидных отложений, а также повреждению клеточного гликокаликса, изъязвлению и разрыву атеросклеротических бляшек. Широкий спектр повреждающего действия активных форм кислорода обусловливает необходимость внутри- и внеклеточной антиоксидантной защиты на основе генной терапии и применения экзогенных биоантиоксидантов. В работе были использованы модифицированные формы супероксиддисмутазы и каталазы, которые ковалентно связывали через хондроитинсульфат (гликозаминогликан сосудистой стенки). Проведенные исследования показали, что полученный биферментный конъюгат обладает более выраженной антитромботической активностью in vivo по сравнению с нативными составляющими. Использование внеклеточных форм биоантиоксидантов открывает новые перспективы разработки высокоэффективных средств защиты сосудистой стенки от действия оксидативного стресса.
Ключевые слова: сосудистая стенка, оксидативный стресс, тромботическое поражение, ферментные антиоксиданты, гликокаликс, гликозаминогликаны, хондроитинсульфат.

A.V. Vavaev, E.G. Tishchenko, L.I. Buryachkovskaya, V.L. Golubykh, A.V. Maksimenko
Institute of Experimental Cardiology, Moscow


The vascular wall: oxidative lesion and extracellular protection
with antioxidative enzymes
Active oxygen forms exert a damaging effect on the vascular wall at all developmental stages of cardiovascular diseases. Oxidative stress contributes to atherogenic modifications of low-density lipoproteins, to the appearance of lipid deposits onto the vascular luminal surface, to the damage to cellular glycocalyx, and to the ulceration and rupture of atherosclerotic plaques. A broad spectrum of damaging activity generates a need for intra- and extracellular protection by gene therapy and the use of exogenous biological antioxidants. The investigations used the modified forms of superoxide dismutase and catalase which were covalently bound through chondroitin sultafe (glycosaminoglycan of the vascular wall). The in vivo studies showed that the resultant bienzyme conjugate had a more significant antithrombotic activity than native components. The use of extracellular bioantioxidants opens up new vistas for the designing of highly agents for the protection of the vascular wall from oxidative stress.
Key words: vascular wall, oxidative stress, thrombotic damage, enzyme antioxidants, glycocalyx, glycosaminoglycans, chondroitin sultafe.


Влияние свободнорадикального окисления на развитие патологических процессов в условиях гипероксии, воспаления, гипоксии и старения общеизвестно. Результаты исследований защитного действия антиоксидантных средств, полученные за последнее десятилетие, противоречивы. Выраженное защитное действие антиоксидантов, регистрируемое в условиях эксперимента, зачастую не подтверждалось в клинических испытаниях. Причиной такого расхождения может быть отсутствие критериев антиоксидантного статуса пациентов [1]. Кроме того, в основном в качестве "антиоксидантов" в клиниках исследовали витаминные препараты, обладающие устойчивым эффектом in vitro, но недостаточной активностью в условиях организма больного [2]. Ферментные средства оказывают на 4–5 порядков более быстрое действие, чем витаминные антиоксиданты (витамины Е или С) [3]. Это позволяет надеяться, что именно антиоксидантные биокатализаторы могут оказаться эффективными при острых поражениях. Уменьшение или предотвращение последних проявляется клинически, и это способствует надежным подтверждением антиоксидантного действия исследуемых препаратов. Наши усилия были сосредоточены на разработке ферментного антиоксидантного состава на основе супероксиддисмутазы и каталазы [4].   

Ферментные антиоксиданты
   
Наиболее часто используемым агентом в экспериментальной антиоксидантной энзимотерапии является супероксиддисмутаза (Cu/Zn-СОД, СОД-1). Однако попытки проведения такой биотерапии оказались неоднозначными, особенно при применении нативной формы фермента [5]. Данные проведенного исследования свидетельствовали о том, что для успешной антиоксидантной защиты сердечно-сосудистой системы необходимо выполнение ряда условий.
   1. Неоспоримым является превентивное введение антиоксидантных средств. Это связано со взрывообразным характером образования активных форм кислорода (АФК), в особенности при острых поражениях; чрезвычайно высокой реакционной способности АФК.
   2. Введенная доза защитного агента должна находиться в терапевтическом интервале его эффективных концентраций (во избежание концентрационной инверсии, когда прямая реакция может сменяться обратной).
   3. Время присутствия препарата в организме должно быть достаточным для достижения лечебного эффекта.
   4. Для увеличения лечебного эффекта и снижения частоты развития осложнений необходима локализация лечебного средства в очаге поражения.
   5. Успех терапии опирается на своевременное выведение или нейтрализацию продуктов антиоксидантной реакции, которые могут оказаться токсичными и провоцировать или усиливать поражение.
   6. Влияние антиоксидантных агентов связано с действием других факторов на смежные системы (иммунный ответ, гемодинамику и др.). Биологическая или химическая модификация антиоксидантных ферментов может позволить достичь коррекции их свойств и соответствия последних большинству из перечисленных условий [5].
   Снижение сродства внеклеточной СОД (СОД-3) к сосудистой стенке, в результате мутагенеза Arg213Gly, существенно снижало эффективность ее антиоксидантного действия в организме [6]. Этот факт подчеркивал значимость адсорбции СОД на сосудистой поверхности для ее антиоксидантной защиты [7]. СОД-1 изначально не обладала таким сродством, что, вероятно, во многом определяло противоречивость полученных данных в экспериментах на животных [5]. При всей доступности и широте использования СОД-1 для энзимотерапии, необходимо повысить ее сродство к сосудистой стенке для обеспечения устойчивого лечебного эффекта. Значимость внеклеточной антиоксидантной защиты подчеркивается возможностью генерирования активных форм кислорода внутри и вне клетки и развитием наружных сосудистых поражений (окисление липопротеинов низкой плотности, появление липидных полос, повреждение гликокаликса, формирование и разрыв атеросклеротических бляшек).   

Рис. 1. Влияние ковалентного конъюгата СОД-ХСу-КАТ: а – на время окклюзии и б – массу образующегося тромба на модели артериального тромбоза у крыс, индуцированного обработкой сосуда насыщенным раствором хлорида железа.

Рис. 2. Антитромботическая активность (интервалы ее действия показаны как темные области на верху диаграммных столбцов) различных комбинаций СОД и КАТ производных и конъюгата СОД-ХСу-КАТ в отношении: а – времени окклюзии и б – массы образующегося тромба.

Рис. 3. Кривые агрегации тромбоцитов, индуцированной 0,5 mМ АДФ (1), а также в присутствии этого индуктора и эквимолекулярных доз каталазных производных: СОДинакт – ХСу – КАТинакт (2), СОД – ХСу – КАТинакт (3), СОДинакт – ХСу – КАТ (4) и СОД – ХСу – КАТ (5).

Повреждение сосудистой поверхности
   
Одним из первых признаков поражения сосудистой стенки АФК является разрушение клеточного гликокаликса, имеющее обратную корреляцию со степенью ингибирования потока АФК [8, 9]. К тому же клеточный гликокаликс может связывать на сосудистой поверхности разные белки (без эндоцитоза), создавая их депо на стенке сосуда [10]. Это указывает на возможность поверхностного удержания белков околоклеточной углеводной оболочкой эндотелия. С помощью лазерного конфокального микроскопа было показано, что флюоресцентно-меченый гепарин, введенный локально после ангиопластики, концентрируется на люминальной поверхности сосудистой стенки [11]. Приведенные данные подтверждают необходимость укрепления/реконструкции сосудистого гликокаликса при поражениях, вызванных АФК, и указывают на возможность использования гликозаминогликанов как векторов к поврежденной клеточной поверхности для транспортировки и удержания на ней белков. С возрастом, а еще интенсивнее, с развитием атеросклеротических поражений, в гликокаликсе человеческих артерий растет содержание хондроитинсульфата (ХСу) [12]. Этот гликозаминогликан оказывается значимым для придания СОД-1 сродства к атерогенным участкам сосудистой стенки. Наряду с этим антиоксидантные ферменты организма млекопитающих – СОД-1 и каталаза (КАТ) – оказались вполне автономными биологическими агентами, не требующими для своего функционирования дополнительных кофакторов и эффекторов. Такая ситуация делает их привлекательными агентами для разработки новых средств антиоксидантной терапии.   

Модифицированные ферментные антиоксиданты
   
После создания модифицированных антиоксидантных ферментов СОД и КАТ [13, 14] было проведено сравнительное изучение эффективности их антитромботического действия на модели артериального тромбоза у крыс, индуцированного обработкой сосуда раствором хлорида железа [15, 16]. О результате действия этих ферментов (в сравнении с контролем) судили по времени наступления артериальной окклюзии и массе образующегося тромба. Ковалентное присоединение СОД или КАТ к гликозаминогликану гликокаликса ХСу придает полученным аддуктам (СОД-ХСу и КАТ-ХСу) выраженную антитромботическую активность, достоверно превосходящую эффекты нативных биокатализаторов, свободного ХСу и их простых смесей. Действие ковалентного конъюгата СОД-ХСу выражалось как в увеличении времени наступления окклюзии сосуда, так и, еще заметнее, в уменьшении массы образующегося тромба [15]. Антитромботическая активность ковалентного конъюгата КАТ-ХСу оказалась наиболее существенной в отношении увеличения времени наступления окклюзии [16]. Ферментативная сопряженность действия СОД с КАТ (когда продукт ферментативной реакции первого биокатализатора является субстратом второго фермента) делает актуальной апробацию одновременного использования активностей СОД и КАТ для защиты сосудистого эндотелия от тромботических осложнений [5].   

Биологическая эффективность ковалентного сопряжения СОД и КАТ
   
На примененной ранее модели артериального тромбоза у крыс проведено сравнительное изучение антитромботической активности смеси производных СОД и КАТ и биферментного ковалентного конъюгата СОД-ХСу-КАТ после превентивного болюсного внутривенного введения таких агентов [17]. Как уже говорилось, экспериментально определяемыми параметрами были время наступления окклюзии и масса тромба. Наряду с контрольной группой (1) крыс (введение физиологического раствора) имелись группы сравнения крыс, которым внутривенно вводили следующие препараты: нативную СОД с нативной КАТ (2), нативные СОД и КАТ со свободным ХСу (3), нативную СОД с КАТ-ХСу (4), нативную КАТ с СОД-ХСу (5), смесь СОД-ХСу с КАТ-ХСу (6) и конъюгат СОД-ХСу-КАТ (7). Сравнение антитромботической активности производных проводили в дозе, ранее определенной нами как оптимальная для активностей СОД и КАТ при введении конъюгата СОД-ХСу-КАТ (рис.1). Величина дозы ориентировочно составила 35–40 ед активности СОД и 80–85 ед активности КАТ на крысу.
   В группах 2–6 влияние производных на время окклюзии достоверно не отличалось от действия физиологического раствора (ANOVA) в контроле (рис. 2). Вероятно, отсутствие преимуществ действия смеси СОД-ХСу с КАТ-ХСу (группа 6) было обусловлено различным внутрисосудистым поверхностным распределением этих производных после внутривенного введения. В этом ряду (группы 2–6) действие смеси нативной КАТ с СОД-ХСу (группа 5) в наибольшей степени превышало контрольные показатели, хотя и в этом случае изменения были недостоверны. Это подчеркивает важность доставки всех трех компонентов исследуемой системы сопряжения ферментов на поверхность клетки. Наиболее выраженным оказался эффект биферментного конъюгата СОД-ХСу-КАТ (см. рис. 2). Его антитромботическое действие достоверно отличалось по сравнению с контролем как в отношении увеличения времени окклюзии (в 2,5–3,5 раза), так и в уменьшении массы тромба (в 1,5–2 раза). Следует отметить, что все исследованные производные обладали сходным антитромботическим эффектом, но различались по концентрационному интервалу своего оптимального действия. Биферментный конъюгат оказывал защитный эффект в значительно более низких дозах (ориентировочно в 50–100 раз меньше дозы нативной СОД и в 200–400 раз меньше дозы нативной КАТ, на порядок меньше, чем СОД-ХСу и КАТ-ХСу).
   Обнаруженные изменения в формировании тромба на фоне применения ферментных производных указали на необходимость более детального изучения их влияния на отдельные звенья тромбообразования. Ключевую роль в этом процессе играют тромбоциты.   

Сравнительное антитромбоцитарное действие СОД-ХСу-КАТ
   
Антитромбоцитарный потенциал производных КАТ, проявляющийся in vivo в изменении массы и проницаемости образующегося тромба [17], оценивали по их действию на агрегацию тромбоцитов добровольцев in vitrо. Агрегацию тромбоцитов индуцировали низкими дозами АДФ (0,5 mM) и перекисью водорода (300 mM) в присутствии разных форм каталазы (КАТ, КАТ-ХСу и СОД-ХСу-КАТ). Перекись водорода была выбрана как наиболее стабильная из активных форм кислорода. Она вызывает агрегацию тромбоцитов, усиливает индуцированную АДФ агрегацию и приводит к изменению формы клеток in vitro. На 1-й минуте образуются крупные рыхлые агрегаты, которые к 4-й минуте уменьшаются в размере за счет дезагрегации и уплотнения оставшихся клеток, что было выявлено с помощью метода флюктуационной агрегатометрии и подтверждено результатами световой и электронной микроскопии. Активирующее действие перекиси водорода на тромбоциты (как самой, так и в сочетании с АДФ) нивелировалось превентивным введением производных КАТ. Нативный фермент КАТ (10 000 Ед/мл) блокирует влияние перекиси водорода на индуцированную АДФ агрегацию тромбоцитов. Ковалентный комплекс КАТ-ХС (4000 Ед/мл) или биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ (1300 Ед/мл) в зависимости от дозы снижают величину агрегации, индуцированную совместным введением АДФ и перекиси водорода. При этом их эффективная доза уменьшалась в ряду (КАТ) Ж (КАТ-ХС) Ж (СОД-ХСу-КАТ). Более того, конъюгат СОД-ХСу-КАТ вызывал уменьшение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ и в отсутствие перекиси. В этом случае эффект КАТ-ХСу был весьма умеренным, а нативная КАТ не обладала им совсем. Сравнительное изучение эффекта производных КАТ показало, что он обусловлен как каталитическим действием фермента, так и большой молекулярной массой биферментного конъюгата [17], что было выявлено, используя производные КАТ разного вида инактивации: СОД-ХСу-КАТ, СОД-ХСу-КАТинакт, СОДинкт-ХСу-КАТ, СОДинакт-ХСу-КАТинакт (рис. 3). Обнаруженный эффект свидетельствует о стерическом предохранении тромбоцитов от активации АДФ ковалентным конъюгатом, молекулярные размеры которого соответствуют нижней полосе размеров наночастиц (более 100 ангстрем). Такие данные свидетельствуют о многостороннем ингибирующем влиянии конъюгата СОД-ХСу-КАТ на активацию тромбоцитов, что актуально для антитромботической защиты сосудистой стенки биофармацевтическими соединениями нового поколения. Добавление нативных ферментов КАТ, СОД и свободного ХСу как по отдельности, так и в простой смеси не влияет на индуцированную АДФ агрегацию тромбоцитов.   

Заключение
   
Анализируемые данные указывают на важность ковалентного сопряжения СОД и КАТ посредством ХСу на клеточной поверхности, а также на значимость соотношения активностей СОД и КАТ и большого молекулярного размера, подобно экстрацеллюлярной СОД [18] антиоксидантных агентов в условиях внеклеточного функционирования. Из этого следует, что конъюгат СОД-ХСу-КАТ представляет собой перспективное производное для антиоксидантной и антитромботической защиты сосудистой стенки.   
   Настоящее исследование было выполнено при финансовой поддержке Росздрава и грантов РФФИ 06-08-00011 и 06-04-08002-офи. Авторы искренне признательны за помощь в экспериментальной работе и ценные дискуссии сотрудникам РКНПК Е.В.Арзамасцеву, З.А.Габбасову, С.П.Голицыну, В.П.Моху, Л.А.Петуховой, Е.Г.Попову, Г.Н.Потаповой, И.А.Учитель.   

Литература
1. Violi F, Loffredo L, Musella L, Marcoccia A. Should antioxidant status be considered in interventional trials with antioxidants? Heart 2004; 90 (6): 598–602.
2. Munzel T, Keaney JF. Are ACE inhibitors a "magic bullet" against oxidative stress? Circulation 2001; 104 (13): 1571–4.
3. Landmesser U, Drexler H. Toward understanding of extracellular superoxide dismutase regulation in atherosclerosis. A novel role of uric acid? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22 (9): 1367–8.
4. Maksimenko AV. Thrombolysis research – new objectives after a shift of accent. Med Sci Monit 2002; 8 (1): 13–21.
5. Maksimenko AV. Experimental antioxidant biotherapy for protection of the vascular wall by modified forms of superoxide dismutase and catalase. Curr Pharm Design 2005; 11 (16): 2007–16.
6. Adachi T, Yamada Y, Morichara N et al. Substitution of glycine for arginine-213 in extracellular-superoxide dismutase impairs affinity for heparin and endothelial cell surface. Biochem J 1996; 313: 235–9.
7. Stralin P, Karlsson K, Johansson BO, Marklund SL. The interstitium of the human arterial wall contains very large amounts of extracellular superoxide dismutase. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15 (11): 2032–6.
8. Beresewisz A, Czarnowska E, Maczewski M. Ischemic preconditioning and superoxide dismutase protect against endothelial disfunction and endotelium glycocalyx disruption in the postischemic guinea-pig hearts. Mol Cell Biochem 1998; 186 (1–2): 87–97.
9. Czarnowska E, Karwatowska-Prokopczuk E. Ultrastructural demonstration of endothelial glycocalyx disruption in the reperfused rat heart. Basic Res Cardiol 1995; 90: 357–64.
10. Bohm T, Geiger M, Binder BR. Isolation and characterization of tissue-type plasminogen activator-binding proteoglycans from human umbilical vein endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1996; 16: 665–72.
11. Tomaru T, Fujimora Y, Morita T et al. Local delivery of antithrombotic drug prevents restenosis after balloon angioplasty in atherosclerotic rabbit artery. Jpn Circ J 1996; 60 (12): 981–92.
12. Lark MW, Yeo T-K, Mar H et al. Arterial chondroitin sulfate proteoglycan: localization with a monoclonal antibody. J Histochem Cytochem 1988; 36 (10): 1211–21.
13. Максименко А.В., Тищенко Е.Г. Ковалентная модификация субъединиц супероксид дисмутазы хондроитин сульфатом. Биохимия. 1997; 62 (10): 1359–63.
14. Максименко А.В., Тищенко Е.Г. Модификация каталазы хондроитин сульфатом. Биохимия. 1997; 62 (10): 1363–6.
15. Maksimenko AV, Tischenko EG, Golubykh VL. Antithrombotic activity of the superoxide dismutase – chondroitin sulfate complexes in a rat model of arterial injury. Cardiovasc Drugs Therapy 1999; 13 (6): 479–84.
16. Maksimenko AV, Golubykh VL, Tischenko EG. Catalase and chondroitin sulfate derivatives against thrombotic effect induced by reactive oxygen species in a rat artery. Metab Eng 2003; 5 (3): 177–82.
17. Maksimenko AV, Golubykh VL, Tischenko EG. The combination of modified antioxidant enzymes for anti-thrombotic protection of the vascular wall: the significance of covalent connection of superoxide dismutase and catalase activities. J Pharm Pharmacol 2004; 56 (11): 1463–8.
18. Marklund SL. Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79 (24): 7634–8.



В начало
/media/cardio/07_01/41.shtml :: Saturday, 30-Jun-2007 21:03:09 MSD
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster