Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 02/N 1/2007 ПЕРЕДОВАЯ СТАТЬЯ

Фармакогенетика, фармакогеномика в свете проблем, связанных с эссенциальной артериальной гипертонией


А.В.Тимофеева, Л.Е.Горюнова, Г.Л.Хаспеков, Д.А.Ковалевский, А.В.Скамров, О.С.Булкина, К.А.Талицкий, Ю.А.Карпов, Р.Ш.Бибилашвили

Институт экспериментальной кардиологии, Институт клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова, Москва

A.V. Timofeeva, L.E. Goryunova, G.L. Khaspekov, D.A. Kovalevsky, A.V. Skamrov, O.S. Bulkina,
K.A. Talitsky, Yu.A. Karpov, R.Sh. Bibilashvili

Institute of Experimental Cardiology,  A.L. Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Moscow
Pharmacogenetics, pharmacogenomics in the light of essential 
hypertenstion-associated problems

Несмотря на внушительный арсенал современных антигипертензивных препаратов (АГП), проблема повышения эффективности лечения артериальной гипертонии (АГ) - одна из наиболее актуальных в здравоохранении экономически развитых стран. Анализ медицинской практики в США показывает [1-6], что целевые уровни артериального давления (АД) достигаются не более чем у 30% больных АГ, получающих антигипертензивную терапию (АГТ) [7]. В последнее время появляется все больше данных о том, что причиной этого являются не только вопросы приверженности лечению и организации здравоохранения, но в значительной степени и индивидуальные особенности организма, определяющие фармакокинетику и фармакодинамику АГП у конкретного больного. Это обстоятельство не учитывают в обычной клинической практике. Отклонения от средних фармакокинетических и фармакодинамических характеристик лекарств могут быть обусловлены индивидуальными свойствами лекарственных мишеней или ферментов, ответственных за транспорт и метаболизм лекарств. Помимо таких очевидных причин, как сопутствующие заболевания или лекарственные взаимодействия, эти отклонения могут быть детерминированы полиморфизмом генов, продукты которых являются мишенями для лекарства или участвуют в его метаболизме, соматическими мутациями (особенно связанными с утерей гетерозиготности в расселяющихся мультипотентных клетках), деметилированием или метилированием промоторов "молчащих" генов и др.
   Успешное завершение в начале XXI века программы "Геном человека" создало предпосылки и необходимый молекулярно-биологический инструментарий для разработки индивидуальных средств лечения и диагностики. Можно упомянуть высокопроизводительные методы анализа полиморфизма генов (например, "HapMap") или кДНК'овые и олигонуклеидные матрицы (microarray) для анализа транскрипции генов и SNP-генотипирования, быстро действующие автоматы для определения полимеразной цепной реакции - ПЦР (real time PCR) и пиросиквенса. Следует также упомянуть о быстро растущем арсенале белковых матриц, создаваемых на основе моноклональных антител, и аппаратов для быстрого определения аффинности с помощью плазмонового резонанса (Proteon, Biacore).
   На основании этих и аналогичных молекулярно-биологических инструментов за последние 6 лет родились и бурно развиваются три новые дисциплины в фармакологии: токсикогеномика, фармакогеномика и фармакогенетика, данные которых наряду с данными классических фармакокинетики и фармакодинамики могут в скором времени стать обязательными для регистрации новых лекарств и новых их комбинаций. Формы соответствующей документации FDA в США уже обсуждаются [8-10].
   Многочисленные примеры успешного применения этих методов для выбора (из нескольких вариантов) оптимальной для данного пациента терапии, отказа от заведомо бесполезного или высокотоксичного для данного больного препарата представлено в литературе уже немало [11-17]. Обсуждаются и причины медленного распространения этих методов в обычной клинической практике, несмотря на их высокую эффективность [18]. Для более широкого внедрения этих методов в практику представляется очевидной необходимость разработки специализированных для каждого заболевания упрощенных вариантов анализа как картины транскрипции, так и карты полиморфизма ограниченной выборки наиболее информативных для данной болезни генов. Отдельного рассмотрения заслуживает применение фармакогеномных подходов для поиска новых мишеней для терапии и предсказания отдаленных последствий продолжительного лечения [19-21].
   Фармакогеномика для фармаколога, изучающего действие определенного препарата, или молекулярного биолога, занимающегося изучением определенного заболевания, и, наконец, для наблюдающего конкретного больного практикующего врача - несколько разные области знания, имеющие дело с различным спектром анализируемых генов. В отличие от фармакогенетического фармакогеномный подход предполагает анализ не одной определенной мишени (гена) на фоне в среднем одинаковой среды, а целого спектра индивидуально вариабельных мишеней.
   Мы исследовали эти спектры применительно к гипертонической болезни (ГБ), или эссенциальной гипертонии.
   При изучении причин индивидуальной неэффективности в среднем эффективных препаратов используют два основных подхода: исследование полиморфизма генов-кандидатов в геноме и влияния последних на фармакокинетику и фармакодинамику или измерение изменения транскрипции генов (по возможности непредвзятого списка всех аннотированных генов) при использовании данного лекарства или данного метода лечения.
   Полиморфизм всех генов, продукты которых взаимодействуют с лекарствами, используемыми для лечения АГ, или определяют их биодоступность и время полувыведения, хорошо исследован и описан во многих обзорах [22-29], в том числе и на русском языке [30]. Наиболее полное описание влияния полиморфизма генов основных участников регуляции АД и ферментов метаболизма применяемых лекарств представлено в обзоре P.Mellen, D.Herrington [31]. Исходный список генов-кандидатов составляют на основе знания, накопленного за предыдущие годы исследований, обо всех участниках процесса регуляции АД (ангиотензин, эндотелины, вазопрессин, брадикинин, альдостерон, простагландины, натрийуретический фактор, адреналин и др.). В список включают все их рецепторы, ферменты, участвующие в их синтезе, деградации и секреции, передаче сигнала от их рецепторов к исполнительным механизмам, ионные насосы и др. Это молекулярно-биологический список. Он включает 75-150 генов [32]. Отдельно по каждому классу лекарств составляют список генов-кандидатов, обеспечивающих процессинг лекарства, его транспортировку и деградацию и/или выведение. Для каждого класса лекарств таких генов 5-10, а всего для АГП набирается 30-40 генов. Это фармацевтический список, так называемые предвзятые (supervised, biased) списки.
   Непредвзятые списки (nonbiased) получают из сравнения картин экспрессии всех генов у нормальных и имеющих АГ лабораторных животных. Но такие сравнения должны проводиться отдельно для каждого органа или ткани и могут включать дополнительные гены (избыточный список генов), активность которых меняется из-за изменения активности генов, непосредственно реагирующих на стимул (например, на лекарство или бессолевую диету). Такие избыточные списки включают обычно 1500-3000 генов. Причины возникающей избыточности хорошо проиллюстрированы в работе B.Joe и соавт. [33].
   Из 75-150 генов-кандидатов, экспрессия которых определяет гомеостаз АД, только для 12-15 генов частота выявления функционального полиморфизма превышает уровень 2-5% для минорного аллеля [32]. Это уровень, который может иметь значение в практической медицине, для того чтобы вместо метода проб и ошибок при выборе терапии врач мог исключить заведомо неэффективную для данного пациента схему лечения. Число генов и полиморфизмов в этом списке достаточно ограничено, чтобы стать применимым в практических целях. Это список для практикующего врача. Можно ожидать появления диагностических наборов на его основе. Ни один из этих часто встречающихся полиморфизмов не коррелирует с АГ и встречается одинаково часто как в популяции людей с нормальным АД, так и в популяции лиц с АГ. При этом многие из этих полиморфизмов влияют на квазистационарную концентрацию продуктов этих генов или эффективность их взаимодействия с партнерами, а также оказывают влияние на рефрактерность больного к тому или иному лекарству или использованию бессолевой диеты. К сожалению, однако, в большинстве случаев разные авторы по не очень понятным причинам в исследованиях получают разные результаты. Причиной может быть отсутствие в каждом из исследований данных полиморфизма по полному списку этих генов или отсутствие в современной модели гомеостаза АД существенных элементов.
   Транскрипция генов с помощью микроэррейной технологии (матриц для транскрипции) измеряется не только для составления списка генов-кандидатов для анализа полиморфизма. Эта технология используется и для прямого изучения индивидуальной чувствительности к АГП и диетам. Она основана на измерении активности генов (транскрипции) и изменения их активности при лечении или в доклиническом исследовании препарата на экспериментальных животных. Как уже упоминалось, такие сравнения должны проводиться отдельно для каждого органа или ткани, и для человека они практически ограничиваются только анализом активности генов в клетках крови. Надо отметить, что опубликованных данных об исследованиях по этому направлению при ГБ очень мало.
   Следует отметить работы по изучению индукции транскрипции генов с помощью солевой диеты у крыс с нормальным АД и крыс со спонтанной АГ, чувствительных к солевой диете, и специально "сконструированных" для этих экспериментов конгенных линий крыс, имеющих замещения в участках хромосом, потенциально ответственных за АГ и переносящих этот признак вместе с переносом участка хромосомы от донора к реципиенту. Всего таких зон у крыс 16. Успешный перенос этого фенотипического признака вместе с переносом части хромосомы может свидетельствовать о существовании наследуемых форм заболевания в отличие от наследуемого фактора риска заболевания.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование (n=20)

Номер образца* Стадия ГБ Возраст, лет Пол САД,

мм рт. ст.

ДАД,

мм рт. ст.

ОХС, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Креатинин,

мкмоль/л

 

Лейкоциты, ґ109 ПОМ и АКС Терапия на момент взятия  крови
H1 II 61 Ж 160 100 5,0 5,9 79 5,1 ПА, ГЛЖ Валсартан
H2 III 69 М 130 90 4,2 4,3 107 5,3 ОНМК Амлодипин
H3 II 59 М 180 100 6,2 6,3 108 6,0 ГЛЖ, НТГ Валсартан
H4 III 68 Ж 160 100 6,6 6,3 89 6,1 ТИА, ПА, НТГ Валсартан
H5 III 66 М 124 80 5,0 4,1 94 4,1 ИБС, ДЭ, ПА, ГЛЖ Амлодипин
H6 III 68 М 140 80 6,1 4,5 103 4,6 ТИА, ГЛЖ Амлодипин
H7 III 64 М 150 90 4,4 4,5 124 7,0 ИБС, ДЭ, ПА Амлодипин
H8 III 66 М 140 80 7,6 5,3 118 5,4 ИБС, ПИКС, ДЭ, ТИА, ПА, ГЛЖ Амлодипин
H9 III 70 Ж 140 80 5,5 6,7 104 6,1 ИБС, ПА, СД Валсартан
H10 III 69 М 140 90 5,1 5,5 101 5,4 ИБС, ДЭ, ПА Валсартан
H11 III 62 Ж 130 70 6,8 6,1 79 6,1 ИБС, ДЭ ТИА, ГЛЖ, НТГ Амлодипин
H12 III 67 М 170 100 8,8 5,6 103 6,2 ИБС, ПА Валсартан
H13 II 65 М 140 80 7,4 4,7 107 4,9 ГАС (II) Валсартан
H14 I 63 М 180 100 4,1 5,8 80 4,9 Нет -
H15 II 53 М 150 100 6,1 5,9 82 4,1 ПА, ГЛЖ -
H16 II 60 М 180 100 7,9 5,7 124 5,1 ПА -
H17 I 47 Ж 160 100 6,1 5,9 95 5,5 Нет -
H18 III 57 Ж 170 110 6,8 6,5 92 5 ИБС, НТГ -
H19 II 39 Ж 170 100 5,9 5,4 74 5 ГАС (II) -
H20 II 61 М 170 90 7,8 6,5 104 4,9 ПА, НТГ -
Примечание. Ж - женщины, М - мужчины;
САД и ДАД - систолическое и диастолическое АД на момент взятия крови;
ОХС - общий холестерин;
ПОМ - поражения органов-мишеней, АКС - ассоциированные клинические состояния (в соответствии с рекомендациями ВНОК по АГ);
ГЛЖ - гипертрофия миокарда левого желудочка;
ГАС - гипертоническая ангиопатия сетчатки (в скобках - степень по Salus);
ИБС - ишемическая болезнь сердца;
ПИКС - постинфарктный кардиосклероз;
ТИА - транзиторные ишемические атаки;
ОНМК - острое нарушение мозгового крвообращения;
ДЭ - дисциркуляторная энцефалопатия;
ПА - периферический атеросклероз (гемодинамически значимое - более 50% - стенозирование сонных артерий и/или артерий нижних конечностей);
НТГ - нарушение толерантности к глюкозе, СД - сахарный диабет.
В соответствующих графах указано содержание лейкоцитов, а также значения уровней глюкозы, креатинина, ОХС, креатинина в сыворотке крови натощак на момент взятия крови.

Таблица 2. Список 25 транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в двух группах пациентов ("H+T" - все "леченые" пациенты, "H" - все "нелеченые" больные ГБ).

Символ гена Имя гена, свойства

H+T

H

К p К p

I. Цитокины и рецепторы, регуляция воспалительного процесса

CX3CR1 Рецептор 1 хемокина группы CX3C (Cx3CL1), атерогенез 3,8 0,00025 5,4 0,00091
CXCR4 Рецептор 4 хемокина группы CXC (CxCL12,SDF1), корецептор вируса HIV 2,1 0,00025 2,6 0,00063
CAGC S100A12, кальцийcвязывающий белок 1,8 0,0092 1,7 0,054
OSM Онкостатин M, калгранулин С, цитокин, воспалительный фактор 1,2 0,1 2,6 0,00041

II. Апоптоз

P53 Белок р53, регулятор апоптоза и транскрипции 1,4 0,003 1,8 0,0084
CASP4 Каспаза 4, цистеиновая протеаза 3,6 0,0036 4,1 0,0063
CASP2 Каспаза 2, цистеиновая протеаза 1,7 0,0013 1,9 0,00091
CASP8 Каспаза 8, цистеиновая протеаза 3,9 0,00017 6,1 0,00021

III. Регуляция транскрипции

EGR1 Транскрипционный фактор, онкосупрессор, регулятор генов системы активного кислорода и Na/K-насоса 4,9 0,00006 1,4 0,064
FLI1 Транскрипционный фактор, фактор интеграции вируса лейкемии Френда, регулятор генов гемостаза и гематопоэза 1,3 0,042 1,6 0,0012
UBID4 DPF2. Zn-зависимый фактор транскрипции, ответственный за ускорение пролиферации и апоптоза гемопоэтических клеток. Партнер RelB-фактора транскрипции 1,8 0,00052 1,8 0,0025
MNDA Транскрипционный фактор, специфичный для миелоидной гранулоцит-макрофагальной линии клеток крови, чувствителен к интерферонам, локализован в ядре 2,4 0,012 3,0 0,0012

IV. Регуляция МАР-киназного сигнального пути

PYST1 DUSP6, MKP3. Фосфатаза двойной специфичности, тип 6. Ингибитор ERK2-, ERK1-зависимых ветвей MAP-киназного сигнального пути регулирования апоптоза, пролиферации, дифференцировки и воспаления, усиливает апоптоз. Локализуется в цитоплазме. Активируется ангиотензином II 2,9 0,0019 4,2 0,00064
PAC1 DUSP2, Фосфатаза двойной специфичности, тип 2, инактивирует ERK1 & ERK2, JNK, p38, ослабляет, вероятно, апоптоз и воспалительный ответ. Локализуется в ядре. Специфичен для гемопоэтической линии клеток 4,1 2E-06 4,4 0,0001
RAFB1 Гомолог B1 онкогена V-RAF 1,6 0,012 1,5 0,0097
RAF1 Гомолог 1 онкогена V-RAF 1,6 0,0065 1,6 0,0046

V. Укладка белков, везикулярный транспорт и стрессорный отклик

HSPA8 Шаперон А8, белок теплового шока 70kD, тип А8 2,6 0,021 4,5 0,0012
HSP40 Шаперон 1, белок теплового шока 40kD, тип 1 1,7 0,00005 2,0 0,0001
GDI1 Регулятор везикулярного транспорта белков 1,3 0,018 1,4 0,025
GDI2 Регулятор везикулярного транспорта белков 2,8 0,0036 3,5 0,0084
IGF2R CD222. Внутриклеточный и внеклеточный рецептор инсулиноподобного фактора 2 и манозо-6-фосфата, направляющий дефектные белки из аппарата Гольджи и внеклеточной жидкости в лизосомы 1,6 0,03 1,4 0,043

VI. Поддержание окислительно-восстановительного потенциала

GLRX Глютаредоксин 4,0 0,0008 4,6 0,0009

VII. Регуляция трансляции и биосинтеза белков

NAT1 EIF4G2, Фактор инициации трансляции 1,4 0,03 1,9 0,0025
Fte-1 Рибосомальный белок S3a 2,7 0,008 3,7 0,088

VIII. Катаболизм глюкозаминогликанов

G6S N-ацетил глюкозоамин-6-сульфатаза 1,9 0,003 1,7 0,015
Примечание. Кратность (К) изменения уровня экспрессии гена для данной группы по отношению к контрольной группе доноров. Стрелка вверх () означает усиление экспрессии, вниз (Ш) - ее ослабление. Достоверность отличий от контроля охарактеризована стандартой величиной р-уровня. Более полное функциональное описание генов может быть получено в базах данных GOA http://www.ebi.ac.uk/GOA/, HPDR http://www.hprd.org/, GENE locus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query. fcgi?db=PubMed

Рис. 1. Гистограмма усредненных значений экспрессии генов в лейкоцитах крови пациентов с АГ по отношению к тем же величинам у здоровых лиц. Гистограмма дана в логарифмической шкале и выражена как кратность изменения уровня экспрессии каждого гена.

 

Рис. 2. Двухмерное кластерирование данных по экспрессии 26 генов в лейкоцитах крови 20 пациентов с АГ и 10 здоровых лиц. Кластерированию подвергался весь набор логарифмированных по основанию 2 данных ОТ-ПЦР, нормированных погенно на усредненную величину интенсивности полос ОТ-ПСР данного гена для всех доноров. Никакой последующей центровки или нормировки данных не производилось. Для расчета меры несходства узлов дерева использовалось эвклидово расстояние и коэффициент корреляции Пирсона. Цветовая шкала, приведенная на врезке, соответствует отношению уровня экспрессии данного гена и данного индивида к среднему для всех доноров по данному гену. Красные квадраты соответствуют увеличению экспрессии в 10 раз и более по сравнению с нормой, зеленые - уменьшению ее в 10 раз и более по сравнению с нормой. Гены обозначены символами в соответствии с табл. 2, пациенты - в соответствии с табл. 1. Индекс "v" - соответствует пациентам, принимавшим валсартан; индекс "a" - амлодипин. Отсутствие индекса означает отсутствие лечения на момент взятия крови. Римские цифры соответствуют стадии ГБ. Шкалы коэффициентов корреляции генов и пациентов отвечают корреляции для узлов дерева.


   Две независимые группы исследователей обнаружили соответственно 2470 и 1560 генов, изменявших свою транскрипцию в сравниваемых группах конгенных крыс в ответ на изменение солевой диеты, сопровождающееся изменением АД. Из них только 7 и 14 генов, соответственно, были локализованы в затронутых зонах первой хромосомы BP_SS1b и BP_SS1a чувствительной к соли линии, и ни один из них не входит в список 75-150 генов-кандидатов, определяющих гомеостаз АД [33, 34].
   Подход, использованный в таких исследованиях по всем 16 зонам, увеличивает список генов-кандидатов в качестве генов-участников процессов регуляции АД до 265, но, к сожалению, в основном за счет генов с неизвестной функцией. В аналогичном исследовании, но с заменой целой 13-й хромосомы, обнаруживали изменения в транскрипции 60 генов в медуллярной зоне почки, 45 из которых имеют определенную функцию и локализацию в геноме, но только один из них кодируется замененной хромосомой и не входит в список 150 генов-кандидатов, влияющих на регуляцию АД [35].
   Здесь необходимо отметить, что полный список генов (около 3000), транскрипция которых изменяется под действием солевой диеты и/или в результате замещения части хромосомы, включает в себя гены, входящие в список 75-150 функциональных генов-кандидатов, влияющих на регуляцию АД. Однако мутированные гены, определяющие наследуемый признак зависимой от соли АГ, кодированные в переносимых участках хромосом, всегда оказываются вне этого списка. Интересно, что обратное для этих генов тоже верно. Мутации и функциональные полиморфизмы, влияющие на свойства или продукцию кодируемых ими белков, не коррелируют c АГ и, соответственно, встречаются одинаково часто у здоровых людей и больных АГ.
   Это, вероятно, свидетельствует о том, что даже основные гены, продукты которых несомненно участвуют в процессах регуляции АД, еще не до конца выявлены. Хорошей иллюстрацией этого утверждения является анализ активности и полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), одного из ключевых звеньев системы регуляции АД и одной из наиболее популярных в течение последних десятилетий мишеней для лекарственной терапии АГ. Интересно, что другой фермент, в той же мере участвующий в метаболизме ангиотензина - АПФ2 (он же рецептор вируса атипичной пневмонии), - до последних лет вообще не рассматривался в качестве участника в системе регуляции АД. Для АПФ2, так же как и для АПФ, субстратом являются ангиотензин I и дополнительно еще desArg брадикинин и ангиотензин II, так что суммарный эффект от АПФ2, в противоположность действию АПФ, сводится к снижению АД [36]. В той же степени недооцененными оказались гены факторов транскрипции и факторов, обеспечивающих межклеточную коммуникацию, и их рецепторов. То же самое относится и к металлопротеиназам и сериновым протеазам. Именно эти гены изменяют экспрессию в ответ на солевую диету или применение диуретиков в экспериментах на животных.
   Наконец, следует отметить, что у трансгенных мышей, не имевших активного гена урокиназы, АД неожиданно оказалось сниженным. Находка, которая может привести к неизвестному еще механизму регуляции АД, возможно, связанному со способностью тканевого активатора плазминогена расщеплять NMDA-рецептор.
   Другая причина несовпадения списка генов, кодирующих наследуемую чувствительную к соли АГ, и списка генов, участвующих в регуляции АД, но не определяющих наследования АГ как болезни, возможно, заключается в том, что последние относятся к генам, кодирующим исполнительные механизмы, обеспечивающие поддержание АД, и их малоэффективная работа может быть компенсирована увеличением концентрации продуктов этих генов.
   В свете проведенного за последние годы широкого скрининга генов-кандидатов на непосредственное участие в регуляции АД и значительного расширения этого списка следует ожидать смещения интереса исследователей, занимающихся изучением полиморфизма генов и разработкой новых лекарственных средств, от исполнительных механизмов к регуляторным. Ранее исследования были сосредоточены вокруг ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, адренергической системы, системы ионных каналов, кинин-калликреиновой и фибриногеновой систем. Новыми мишенями, вероятно, станут наряду с другими и ферментные системы метаболизма триптофана, определяющие синтез серотонина, мелатонина, глицина, глутаминовой кислоты и кинуреновой кислоты (кинурената) и связанных с ними рецепторов - никотиновых, серотониновых и глутаматных.
   Транскриптом клеток крови. Особняком стоят исследования изменения картины экспрессии генов в лейкоцитах крови больных АГ. Таких работ в связи с ГБ пока опубликовано только две. Это работа H.Сhon и соавт. [37] и наше недавнее сообщение [38]. Основная задача, которая решалась в этих работах, не связана напрямую с проблемой персонализации лечения, а скорее с вопросом, в какой степени изменения в экспрессии генов в лейкоцитах периферической крови больных АГ являются обратимыми в результате лечения, а также могут ли такие изменения служить маркерами заболевания и средством мониторирования хода лечения болезни.
   Каким образом транскриптом клеток крови может быть связан с АГ? В патогенезе поражения органов-мишеней при АГ большую роль играют клеточные механизмы. Гемодинамическое воздействие повышенного АД на сосудистую стенку запускает внутриклеточные сигнальные пути, в норме предназначенные для проведения сигналов от рецепторов ростовых факторов [39-43]. В результате активируются такие клеточные реакции, как воспаление, пролиферация и апоптоз [44]. Недавно было показано, что аналогичные изменения в ответ на механические стимулы происходят не только в сосудистой стенке, но и в клетках крови [45-47], что приводит к активации лейкоцитов, продукции ими активных форм кислорода и инициации неспецифического воспаления в сосудистой стенке с повреждением ее эндотелия [48]. Показано, что лейкоциты, выделенные из крови больных АГ, активнее продуцируют супероксид-анион, чем лейкоциты, взятые из крови здоровых лиц; в то же время уровень восстановленного глутатиона в крови у первых в 2 раза выше, чем у вторых, что свидетельствует о наличии системного окислительного стресса [49]. Большинство внутриклеточных сигнальных путей влияет на экспрессию определенных генов. Поэтому анализ экспрессионной активности этих генов в лейкоцитах может указать на особенности лейкоцитарного микроокружения. Наконец, какова бы ни была причина возникновения устойчивой АГ, наличие ее всегда коррелирует с возникновением и усугублением структурных изменений сосудистой стенки - атерогенезом, который в свою очередь, замыкая петлю обратной связи, становится независимым от первичной причины источником развития АГ. При этом реализация такого механизма усугубления патологии может привести к рефрактерности больного к первоначально эффективным лекарствам.
   Одной из причин возникновения структурных изменений сосудов при АГ является воспалительная инфильтрация сосудистой стенки активированными клетками крови, приводящая к снижению эластических свойств сосудов, ускорению атерогенеза, активации свертывающей системы, и, следовательно, к увеличению риска сердечно-сосудистых осложнений у больных АГ.
   Очевидно также, что клетки крови должны реагировать и на лекарственную терапию. Эти обстоятельства и определяют выбор лейкоцитов периферической крови в качестве объекта исследования при АГ и реакции организма на АГТ. Хотя лейкоциты и не могут сами по себе быть ответственными за развитие АГ, но изменение их транскриптома может служить, с одной стороны, показателем эффективности лекарственной терапии, а с другой - ее объектом, так как целью терапии должно быть не только снижение АГ, но и восстановление нормального, не "воспаленного" статуса лимфоцитов периферической крови.
   Для выявления у больных АГ генов с измененной экспрессионной активностью (по сравнению с их активностью у здоровых доноров) в обоих случаях был применен метод транскрипционных матриц, позволяющий анализировать экспрессию нескольких тысяч генов одновременно. Обе работы носят характер пилотного исследования с числом пациентов в группах не более 7. Нашей задачей было выявление общих для всех больных АГ изменений активности генов, не зависящих от стадии болезни и проводимого лечения, поэтому мы не применяли жесткие критерии при отборе пациентов. H.Chon и соавт. исключали данные больных, у которых в результате лечения не нормализовался уровень АД и имелись признаки повреждения органов и сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой системы или почечной недостаточности и метаболического синдрома. Было отмечено изменение активности 680 генов, большая часть из которых показывала корреляцию с полом. После лечения ингибиторами АПФ (3 человека) или b-блокаторами (3 человека) уровень экспрессии почти всех генов нормализовался. Изменения активности 10 цитокиновых генов, 4 генов рецепторов серотонина, гена рецептора ангиотензина II и гена эндотелинпревращающего фермента были подтверждены сопряженной реакцией обратной транскрипции и ПЦР (ОТ-ПЦР). Авторы отметили сходство наблюдаемых изменений в экспрессии генов с таковыми при атеросклерозе. К сожалению, разброс результатов по отдельным больным и здоровым донорам не может быть оценен, так как авторы не привели в статье оригинальных данных по каждому пациенту.
   В нашем исследовании мы обнаружили у больных АГ около 80 генов (из 2500 исследованных) с достоверно измененной транскрипцией, т.е. примерно ту же долю (около 3%), что и H.Chon и соавт. [37], хотя в нашей выборке больных только двое соответствовали выборке в их работе (ГБ I стадии).
   Для анализа профиля экспрессии генов мы использовали РНК, выделенную из лейкоцитарной фракции крови больных ГБ. У 2 больных АГ носила транзиторный характер (ГБ I стадии), у 7 была II стадия ГБ, у 11 больных - III стадия ГБ. На момент взятия крови 7 больных не получали АГТ, остальные 13 принимали либо валсартан - блокатор рецепторов ангиотензина II, либо амлодипин - блокатор кальциевых каналов (табл. 1). Всех включенных в исследование разделили на 3 группы: больные АГ, не получавшие лечения до момента взятия крови (1), больные АГ, получавшие лечение (2), здоровые доноры (3). Образцы РНК от испытуемых каждой группы смешивали в равных пропорциях. Полученные смеси индивидуальных образцов РНК, характеризующие каждую группу в целом, анализировали в дальнейшем методом транскрипционных матриц. Полученные результаты подвергали статистической обработке с целью выявить гены, уровень экспрессии которых у больных АГ достоверно отличался бы от уровня у здоровых лиц независимо от наличия или отсутствия лечения. Таким образом выявили 80 генов с измененной экспрессией, из которых для дальнейшего изучения выбрали 40 (экспрессия 31 гена усилена, 9 ослаблена по сравнению с их экспрессией у здоровых). Экспрессию каждого из генов, выявленных в пулированных образцах крови, в дальнейшем исследовали методом ОТ-ПЦР в индивидуальных образцах РНК. Результаты, отражающие содержание мРНК каждого гена у конкретного пациента, усредняли для каждой группы. Эти данные сопоставляли с результатами, полученными с помощью гибридизации на транскрипционных матрицах. Совпадение результатов, полученных двумя методами, отмечено для 25 генов. В табл. 2 приводятся результаты для этих 25 генов.
   Анализ результатов, приведенных на рис. 1, показывает, что по сравнению с нормой активность системы генов, ответственных за апоптоз, воспалительный ответ, пролиферацию, внутриклеточный транспорт, клеточный стресс, поддержание окислительно-восстановительного равновесия в клетке, увеличена. Это может служить указанием на общее усиление метаболических процессов и активности клеток крови при АГ. Прoтивоположно направленое изменение экспрессии внутри пар генов хемокиновых рецепторов CXCR4 и CX3CR1 и фосфатаз PAC-1 и PYST-1 может свидетельствовать об ослаблении процессов дифференцировки поступающих в кровь незрелых клеток и усилении воспалительных процессов и апоптоза.
   Учитывая важную роль в патогенезе АГ процессов неспецифического воспаления сосудистой стенки, у больных АГ прежде всего обращает на себя внимание усиление экспрессии генов, вовлеченных в воспалительный ответ. К их числу относится, например, ген CAGC, продукт которого - связывающий кальций белок S100А12 - непосредственно вызывает активацию эндотелиальных клеток, моноцитов и лимфоцитов, что индуцирует экспрессию ими ряда провоспалительных цитокинов (IL-1b, TNF-a) и молекул адгезии. Кроме того, обнаружено разнонаправленное изменение экспрессии генов рецепторов хемокинов CXCR4 (ослабление) и CX3CR1 (усиление). Рецептор CXCR4 широко представлен на поверхности моноцитов, В-лимфоцитов и большинства субпопуляций Т-лимфоцитов и лишь изредка обнаруживается на поверхности NK-клеток (естественных киллеров). В то же время CX3CR1 в основном локализуется на мембране естественных киллеров, макрофагов и цитотоксических Т-лимфоцитов. В отличие от CXCR4 и других хемокиновых рецепторов связь CX3CR1 со своим лигандом осуществляется без участия интегринов, что обеспечивает захват лейкоцитов сосудистой стенкой даже при высоких скоростях кровотока. Таким образом, у больных АГ увеличение экспрессии в лейкоцитах CX3CR1 и ослабление CXCR4 может обеспечивать усиленную адгезию к эндотелию и миграцию в сосудистую стенку естественных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов, что является одним из ключевых механизмов повреждения сосудистой стенки при АГ.
   Процессы ремоделирования тканей при АГ в значительной степени связаны с такими клеточными реакциями, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз, в регуляции которых важнейшую роль играет внутриклеточный сигнальный каскад МАР-киназ. Нами у больных АГ было выявлено изменение активности генов, кодирующих два основных ингибитора МАР-киназ - PAC-1 и PYST-1. Продукты экспрессии этих генов специфически инактивируют определенные ферменты МАР-киназного каскада. Белок PYST-1 (DUSP6) инактивирует МАР-киназы ERK-1 и ERK-2, однако не действует на такие компоненты каскада, как JNK/SAPK и p38, которые специфически инактивируются другими ферментами - PAC-1 (DUSP2) и DUSP1. В лейкоцитах, взятых от больных АГ, мы обнаружили значительное усиление экспрессии PYST-1, что может приводить к подавлению активности МАР-киназ ERK1/2 (MAPK1, MAPK3), отвечающих за проведение сигналов от рецепторов ростовых факторов, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток. Уровень же экспрессии РАС-1 был, напротив, снижен, несмотря на увеличение экспрессии p53, активирующего транскрипцию РАС1. Это может способствовать усилению активности МАР-киназ JNK/SAPK и p38, которые активируются стрессом и контролируют продукцию провоспалительных цитокинов и вступление клетки в апоптоз. Такая особенность экспрессии генов PYST-1 и РАС-1 у больных АГ, приводящая к смещению баланса внутриклеточных сигнальных каскадов и в конечном счете к изменению поведения клетки, может лежать в основе процессов, ответственных за поражение органов-мишеней при АГ. Нами также было обнаружено усиление экспрессии генов, кодирующих ферменты апоптотического каскада (каспазы 2, 4, и 8, белок р53 и др.), что подтверждает наши предположения об усилении апоптотических процессов в лейкоцитах при АГ, в том числе вследствие изменения активности генов PYST-1 и РАС-1.
   Причиной усиленного апоптоза лейкоцитов при АГ могут быть и нарушения системы белков теплового шока. Относящиеся к этой группе белки Hsp70 и Hsp40 отвечают за правильное формирование третичной структуры большинства цитозольных белков. Нарушение функции этой системы приводит к накоплению в клетке белков со структурными дефектами, которые часто способны к спонтанной агрегации, токсичны для клетки и могут приводить к клеточной гибели. С другой стороны, известна роль Hsp70 как важного фермента антиоксидантной защиты. В лейкоцитах у больных АГ нами было выявлено снижение экспрессии Hsp40 и увеличение экспрессии Hsp70, что наряду с усилением экспрессии гена глутатион-пероксидазы - ключевого фермента антиоксидантной защиты клетки - может отражать компенсаторные изменения, направленные на противодействие оксидативному стрессу, роль которого в патогенезе АГ также хорошо известна. В частности, процессы свободнорадикального окисления инактивируют продуцируемый эндотелием оксид азота и стимулируют пролиферацию гладкомышечных клеток сосудистой стенки. Индивидуальная реакция больных на использованную терапию может быть прослежена по данным, представленным на рис. 2.
   Видно, что разброс уровня экспрессии генов у здоровых лиц значительно меньше, чем у больных. Все пациенты четко разделяются на пять кластеров в соответствии с наличием или отсутствием заболевания и способом лечения. Здоровые лица относятся к кластеру 3 (кроме № 5). Нелеченые пациенты - к кластеру 1b, леченные валсартаном - к кластеру 1а, а леченные амлодипином - к кластерам 1с и 2. Все гены, принадлежащие кластеру 2, независимо от лечения характеризуются пониженной экспрессией у больных АГ, тогда как гены, принадлежащие кластеру 3, - повышенной экспрессией. Экспрессия генов кластеров 4, 5 и 6, повышенная у больных АГ, имеет тенденцию к снижению при лечении амлодипином, но не меняется при лечении валсартаном.
   На основании результатов, полученных в этих двух пилотных исследованиях, можно заключить, что изучение транскриптома клеток крови при ГБ полезно для мониторирования течения болезни. Может быть выбран ограниченный набор генов, наиболее информативных для такого мониторирования. Для этого требуются дополнительные исследования с более тщательным подбором больных и более широким выбором средств лечения.   

Литература
1. Shastry BS. Genetic diversity and new therapeutic concepts. J Hum Genet 2005; 50: 321-8.
2. Ament PW, Bertolino JG, lliszewski JL. Clinically significant drug interactions. Am Fam Physician 2000; 61: 1745-54.
3. Gandhi TK, Weingart SN, Borus J et al. Adverse drug events in ambulatory care. N Engl J Med 2003; 348: 1556-64.
4. Dormann H, Neubert A, Criegee-Rieck M et al. Readmissions and adverse drug reactions in internal medicine: the economic impact. J Inttions in internal medicine: the economic impact. J Intern Med 2004; 255: 653-63.
5. Lazarou J, Pomeranz BH, Corey PN. Incidence of adverse drug reactions in hospitalized patients. JAMA 1998; 297: 1200-5.
6. Muehlberger N, Schneeweiss S, Hasford J. Adverse drug reaction monitoring cost and benefit consideration:frequency of adverse drug reactions causing hospital admissions. Pharmacoepidemiol Drug Saf 1997; 6: S71-7.
7. Sadee W, Dai Z. Pharmacogenetics/genomics and personalized medicine. Human Molecular Genetics 2005; 14: R207-14.
8. Freeman K. Toxicogenomics data: the road to acceptance. Environ Health Perspect 2004; 112: A678-85.
9. Leighton JK, Brown P, Ellis A et al. Workgroup report: review of genomics data based on experience with mock submissions-view of the CDER pharmacology toxicology nonclinical pharmacogenomics subcommittee. Environ Health Perspect 2006; 114: 573-8.
10. Hayes KR, Vollrath AL, Zastrow GM et al. EDGE: A centralized resource for the comparison, analysis, and distribution of toxicogenomic information. Mol Pharmacol 2005; 67: 1360-8.
11. Yamayoshi Y, Iida E, Tanigawara Y. Cancer pharmacogenomics: international trends. Int J Clin Oncol 2005; 10: 5-13.
12. Lee W, Lockhart AC, Kim RB, Rothenberg ML. Cancer pharmacogenomics: powerful tools in cancer chemotherapy and drug discovery. Oncologist 2005; 10: 104-11.
13. Kajinami K, Akao H, Polisecki E, Schaefer EJ. Pharmacogenomics of statin responsiveness. Am J Cardiol 2005; 96: 65K-70K.
14. Liljedahl U, Kahan T., Malmqvist K et al. Single nucleotide polymorphisms predict the change in left ventricular mass in response to antihypertensive treatment. J Hypertens 2004; 22: 2321-8.
15. Shah R, Darne B, Atar D et al. Pharmacogenomics in cardiovascular clinical trials. Fundam Clin Pharmacol 2004; 18: 705-8.
16. Siest G, Jeannesson E, Berrahmoune H et al. Pharmacogenomics and drug response in cardiovascular disorders. Pharmacogenomics 2004; 5: 779-802.
17. Winkelmann BR, Marz W, Boehm BO et al. Rationale and design of the LURIC study-a resource for functional genomics, pharmacogenomics and long-term prognosis of cardiovascular disease. Pharmacogenomics 2001; 2: S1-73.
18. Shah J. Criteria influencing the clinical uptake of pharmacogenomic strategies. BMJ 2004; 328: 1482-6.
19. Mehraban F, Tomlinson JE. Application of industrial scale genomics to discovery of therapeutic targets in heart failure. Eur J Heart Fail 2001; 3: 641-50.
20. Schelleman H, Stricker BH, De Boer A et al. Drug-gene interactions between genetic polymorphisms and antihypertensive therapy. Drugs 2004; 64: 1801-16.
21. Le Bouter S, El Harchi A, Marionneau C et al. Long-term amiodarone administration remodels expression of ion channel transcripts in the mouse heart. Circulation 2004; 110: 3028-35.
22. Trotta R, Donati MB, Iacoviello L. Trends in pharmacogenomics of drugs acting on hypertension. Pharmacol Res 2004; 49: 351-6.
23. Arnett DK, Claas SA, Glasser SP. Pharmacogenetics of antihypertensive treatment. Vascul Pharmacol 2006; 44: 107-18.
24. Turner ST, Schwartz GL, Chapman AB et al. Antihypertensive pharmacogenetics: getting the right drug into the right patient. J Hypertens 2001; 19: 1-11.
25. Cadman PE, O'Connor DT. Pharmacogenomics of hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens 2003; 12: 61-70.
26. Schelleman H, Stricker BH, Verschuren WM et al. Interactions between five Candidate genes and antihypertensive drug therapy on blood pressure. Pharmacogenomics J 2006; 6: 22-6.
27. Filigheddu F, Troffa C, Glorioso N. Pharmacogenomics of essential hypertension: are we going the right way? Cardiovascular Hematological Agents Med Chemist 2006; 4: 7-15.
28. Mein CA, Caulfield MJ, Dobson RJ, Munroe PB. Genetics of essential hypertension. Human Molecular Genetics 2004; 13: R169-75.
29. Arnett DK, Davis BR, Ford CE et al. Hypertension-Associated Treatment (GenHAT) Study relation to antihypertensive treatment: the genetics of insertion/deletion polymorphism on blood pressure and cardiovascular risk in pharmacogenetic association of the angiotensin-converting enzyme. Circulation 2005; 111: 3374-83.
30. Минушкина Л.О., Затейщиков Д.А., Сидоренко Б.А. Индивидуальная чувствительность к антигипертензивным препаратам: генетические аспекты. Кардиология. 2005; 7: 58-65.
31. Mellen PB, Herrington DM. Pharmacogenomics of blood pressure response to antihypertensive treatment. J Hypertens 2005; 23: 1311-25.
32. Halushka MK, Fan JB, Bentley K et al. Patterns of single-nucleotide polymorphisms in Candidate genes for blood-pressure homeostasis. Nature Genetics 1999; 22: 239-47.
33. Joe B, Letwin NE, Garrett MR, Dhindaw S et al. Transcriptional profiling with a blood pressure QTL interval-specific oligonucleotide array Physiol Genomics 2005; 23: 318-26.
34. Yagil С, Hubner N, Monti J et al. Identification of hypertension-related genes through an integrated genomic-transcriptomic approach. Circ Res 2005; 96: 617-25.
35. Mingyu L, Yuan B, Rute E et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics 2002; 8: 139-49.
36. Danilczyk U, Eriksson U, Crackower MA, Penninger JM. A story of two ACEs. J Mol Med 2003; 81: 227-34.
37. Chon H, Gaillard CAJM, van der Meijden BB et al. Broadly altered gene expression in blood leukocytes in essential hypertension is absent during treatment. Hypertension 2004; 43: 947-51.
38. Timofeeva AV, Goryunova LE, Khaspekov GL et al. Altered gene expression pattern in peripheral blood leukocytes from patients with arterial hypertension. Ann NY Acad Sci 2006; 1091: 319-35.
39. Lifton RP, Gharavi AG, Geller DS. Molecular mechanisms of human hypertension. Cell 2001; 104: 545-56.
40. Olsen MH, Wachtell K, Hermann KL et al. Is cardiovascular remodeling in patients with essential hypertension related to more than high blood pressure? Am Heart J 2002; 144: 530-7.
41. Plante GE. Vascular response to stress in health and disease. Metabolism 2002; 51: 25-30.
42. Dao HH, Martens FM, Lariviere R et al. Transient involvement of endothelin in hypertrophic remodeling of small arteries. J Hypertens 2001; 19: 1801-12.
43. Van Zwieten PA. The role of angiotensin II receptors and their antagonists in hypertension. Ann Ital Med Int 2000; 15: 85-91.
44. Shaw A, Xu Q. Biomechanical stress-induced signaling in smooth muscle cells: an update. Curr Vasc Pharmacol 2003; 1: 41-58.
45. Stevenson JR, Westermann J, Liebmann PM et al. Prolonged alpha-adrenergic stimulation causes changes in leukocyte distribution and lymphocyte apoptosis in the rat. J Neuroimmunol 2001; 120: 50-7.
46. Hahn AW, Jonas U, Buhler FR, Resink TJ. Activation of human peripheral monocytes by angiotensin II. FEBS Lett 1994; 347: 178-80.
47. Ohki R, Yamamoto K, Mano H et al. Identification of mechanically induced genes in human monocytic cells by DNA microarrays. J Hypertens 2002; 20: 685-91.
48. Smedly LA, Tonnesen MG, Sandhaus RA et al. Neutrophil-mediated injury to endothelial cells. J Clin Invest 1986; 77: 1233-43.
49. Kristal B, Shurtz-Swirski R, Chezar J et al. Participation of peripheral polymorphonuclear leukocytes in the oxidative stress and inflammation in patients with essential hypertension. Am J Hypertens 1998; 11: 921-8.



В начало
/media/cardio/07_01/5.shtml :: Saturday, 30-Jun-2007 21:03:11 MSD
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster