Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 02/N 2/2007 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Реперфузия метаболическими протекторами уменьшает гибель кардиомиоцитов после окклюзии коронарной артерии у крыс


О.И.Писаренко, Л.И.Серебрякова, О.В.Цкитишвили, И.М.Студнева

Институт экспериментальной кардиологии

Цель исследования. Изучить влияние внутривенного введения аспартата калия и магния (К-Мg-Асп), смеси глюкоза–инсулин–калий (ГИК), комбинации глюкозы, инсулина с аспартатом калия (ГИКАсп) и одного инсулина (И) после периода региональной ишемии миокарда на метаболизм зоны риска (ЗР) и повреждения клеточных мембран кардиомиоцитов у крыс.
Материалы и методы. Острый инфаркт миокарда (ИМ) моделировали 40-минутной окклюзией передней нисходящей коронарной артерии и 60-минутной реперфузией. Во время реперфузии в яремную вену со скоростью 1 мл/кг/ч вводили один из растворов: физиологический раствор (контроль), К-Мg-Асп, ГИК, ГИКАсп или И. По окончании опытов определяли размеры ИМ или замораживали биоптаты ЗР в жидком азоте для определения метаболитов.
Результаты. Размеры ИМ в экспериментальных группах были достоверно меньше, чем в контроле, и снижались в ряду К-Мg-Асп>ГИКАсп>И>ГИК. Под действием протекторов содержание аденозинтрифосфата (АТФ) и фосфокреатина в ЗР к концу реперфузии восстанавливалось в 2–2,5 раза лучше, чем в контроле (в среднем до 56,3±3,4 и 81,8±7,9% от исходных значений). В экспериментальных группах потери фонда аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также накопление лактата и глюкозы в ЗР были достоверно ниже, чем в контроле. Содержание общего креатина (
SКр) в ЗР в конце реперфузии в контроле было снижено до 32,3±2,3%, а под влиянием ГИК, И и К-Мg-Асп увеличивалось до 78,0±5,7; 76,7±5,5 и 62,4±5,6% от исходного значения соответственно. В целом восстановление большинства показателей аэробного обмена и целостности мембран кардиомиоцитов было максимальным в группах И и ГИК и недостоверно ниже после реперфузии К-Мg-Асп.
Заключение. Метаболическая эффективность протекторов соответствовала ограничению размеров ИМ. Использование метаболической защиты миокарда с помощью ГИК, И и К-Мg-Асп перспективно в качестве дополнительной терапии у пациентов с острым ИМ.
Ключевые слова: реперфузия сердца, макроэргические фосфаты, аминокислоты, мембраны кардиомиоцитов, механизмы действия.

O.I. Pisarenko, L.I. Serebryakova, O.V. Tskitishvili, I.M. Studneva
Institute of Experimental Medicine

Reperfusion with metabolic protectors reduces cardiomyocytic death rates after coronary occlusion in rats

Aim. To evaluate the effect of intravenous injection of potassium aspartate and magnesium aspartate (K-Mg-Asp), a glucose-insulin-potassium (GIP) mixture, a combination of glucose, insulin with potassium aspartate (GIPAsp), and insulin (I) alone after myocardial regional ischemia on the metabolism of a risk area (RA) and after cardiomyocytic membranous damage in rats.
Materials and methods. Acute myocardial infarction (MI) was simulated by 40-minute occlusion of the anterior descending coronary artery and by 60-minute reperfusion. During reperfusion, one of the solutions (physiological solution (a control group), K-Mg-Asp, GIP, GIPAsp, or I) was injected into the jugular vein at a rate of 1 ml/kg/hr. After completion of the experiments, the extent of MI was estimated or the RA biopsy specimens were frozen in liquid nitrogen for the determination of metabolites.
Results. In the experimental groups, the extent of MI was significantly less than that in the control and was in the descending order of K-Mg-Asp>GIPAsp>I>GIP. By the end of reperfusion, the use of the protectors restored the RA levels of adenosine triphosphate and phosphocreatine by 2-2.5 times greater than that in the control (mean up to 56.3±3.4 and 81.8±7.9% of the baseline values, respectively). In the experimental groups, the losses of the stores of aspartic and glutamic acids and the accumulation of lactate and glucose in RA were significantly less than those in the control. At the end of reperfusion, the RA content of total creatine (
SCr) decreased to 32.3±2.3% in the control, but, when GIP, I, or K-Mg-Asp was administered, increased up to 78.0±5.7, 76.7±5.5, and 62.4±5.6% of the baseline value, respectively. By and large the recovery of most parameters of aerobic metabolism and the integrity of cardiomyocytic membranes was a maximum in the I- and GIP-groups and insignificantly less after reperfusion with K-Mg-Asp.
Conclusion. The metabolic efficacy of the protectors corresponded to the limit of MI extent. Myocardial metabolic protection with GIP, I, And K-Mg-Asp was promising as a supplementary therapy in patients with acute MI.
Key words: cardiac reperfusion, energy-rich phosphates, amino acids, cardiomyocytic membranes, mechanisms of action.

Реперфузия постишемического миокарда не всегда способна обеспечить адекватное восстановление аэробного обмена и функции сердца. Отсутствие оптимальных условий для защиты реперфузируемого миокарда при возобновлении коронарного кровотока диктует необходимость использования кардиопротекторов, корректирующих метаболизм [1]. Для снижения ишемических и реперфузионных повреждений миокарда применяются протекторы, в состав которых входят естественные метаболиты сердца – аминокислоты, глюкоза и инсулин (И). К наиболее распространенным из них относятся “метаболический коктейль” глюкоза–инсулин–калий (ГИК) и регулятор внутриклеточного ионного гомеостаза аспарагинат калия и магния (К-Мg-Асп), известный под названием панангин, или аспаркам.
   Кардиозащитное действие К-Мg-Асп обычно связывают с транспортом К+ и Мg2+ с помощью аспартата2+ в миокардиальные клетки, что устраняет дисбаланс электролитов, предотвращая перегрузку кардиомиоцитов ионами Са2+ и Nа+. Следствием этого является снижение возбудимости и проводимости миокарда при реперфузии и уменьшение частоты возникновения аритмий [2]. Наряду с улучшением электрофизиологических характеристик аспарагиновая кислота способна запускать компенсаторные механизмы образования аденозинтрифосфата (АТФ) и ГТФ в митохондриях и цитозоле в условиях сниженного обеспечения клеток кислородом [3, 4]. Результатом этого может быть уменьшение потерь макроэргических фосфатов на стадии ранней реперфузии. При последующем восстановлении аэробного обмена увеличение внутриклеточной концентрации аспарагиновой кислоты в кардиомиоцитах способствует ресинтезу адениннуклеотидов и фосфокреатина [5].
   В экспериментальных и клинических исследованиях установлено, что ГИК снижает уровень циркулирующих в крови свободных жирных кислот (СЖК) и их потребление миокардом [6]. Это уменьшает токсическое действие СЖК на ишемизированный миокард, связанное с повреждением мембран, которое приводит к возникновению аритмий и подавлению функции сердца [7]. Кроме того, ГИК увеличивает захват К+ миоцитами благодаря стимуляции активности Na+/K+-АТФазы инсулином и способствует транспорту глюкозы в клетки [8]. Увеличение гликолитического потока не только поддерживает более высокие уровни АТФ и фосфокреатина (ФКр) в условиях ишемии, но и снижает внутриклеточные концентрации аденозиндифосфата (АДФ) и неорганического фосфата, что значительно увеличивает свободную энергию гидролиза АТФ при протекании всех АТФазных реакций. Образующийся в гликолизе АТФ обеспечивает сохранение структуры плазматической мембраны и работу ионных насосов, уменьшая перегрузку миоцитов ионами C
a2+ [9]. Эти метаболические перестройки хорошо объясняют способность ГИК препятствовать развитию контрактуры и улучшать работу сердца при ишемии.
   Хотя К-Мg-Асп и ГИК длительное время применяются для лечения и профилактики нарушений структур и функции сердца разной природы, их влияние на необратимые повреждения кардиомиоцитов и метаболизм миокарда при реперфузии практически не изучено. Недавно в ряде лабораторий было установлено ограничение размеров инфаркта миокарда (ИМ) при использовании ГИК только во время реперфузии [10, 11]. Было высказано предположение о том, что этот эффект мог быть обусловлен как антиапоптотическим действием И, так и влиянием ГИК на метаболизм постишемических миоцитов [12–14].
   Целью настоящей работы являлось изучение способности К-Мg-Асп, ГИК, комбинации глюкозы, И с аспартатом калия (ГИКАсп) и одного И ограничивать размеры ИМ у крыс при их введении на стадии ранней реперфузии. Для понимания механизмов защитного действия кардиопротекторов было изучено их влияние на метаболизм зоны риска (ЗР) и повреждение клеточных мембран миоцитов в конце реперфузии.

Материалы и методы
   
Препарирование животных. Эксперименты проводили на крысах-самцах Вистар массой 300–450 г, наркотизированных кетамином (100 мг/кг веса внутрибрюшинно). Искусственную вентиляцию легких осуществляли комнатным воздухом с добавлением кислорода с частотой 60–80 в 1 мин, под постоянным контролем насыщения кислородом артериальной крови. Правую яремную вену катетеризировали для введения гепарина и испытываемых растворов. Левую сонную артерию катетеризировали для регистрации артериального давления (АД; “Мингограф-804”, “Siemens Elema”) и взятия проб артериальной крови (“ABL-30”, “Radiometer”, Копенгаген). Грудную клетку вскрывали во II–IV межреберье слева или продольным рассечением грудины, и освобождали сердце от перикарда.
   Для создания региональной ишемии миокарда левый желудочек (ЛЖ) прошивали атравматической иглой 5–0 под левым ушком в направлении, перпендикулярном большой оси сердца. Затягивание лигатуры на передней нисходящей коронарной артерии (ПНА), находящейся в толще прошитого миокарда, прекращало кровоснабжение перфузируемого ею участка миокарда и вызывало образование цианозного пятна на поверхности миокарда. Ослабление лигатуры приводило к восстановлению кровотока и исчезновению цианозного пятна. По окончании опытов сердце окрашивали 2% раствором Эванса синего, введенным через яремную вену при затянутой лигатуре, отделяли ЛЖ, который замораживали при –20оС для последующей гистохимической обработки [15]. В отдельных сериях опытов ЗР ЛЖ быстро вырезали и замораживали щипцами Волленбергера, охлажденными в жидком азоте, для последующей оценки метаболического состояния.

Таблица 1. Изменения в содержании метаболитов энергетического обмена в ЗР левого желудочка сердца крысы при региональной ишемии и реперфузии (M±m; мкмоль/г сухого веса ткани)

Группа

АТФ

ФКр

Креатин

Исходное состояние

22,39±1,20

23,78±1,59

35,49±2,13

Контроль

5,26±0,61а

7,53±0,87а

11,62±1,87а

К-Мg-Асп

11,35±0,75а,б

18,87±1,74a,б

18,67±2,34a,б

ГИК

13,96±1,06а,б

20,14±2,76а,б

27,31±3,14а,б

И

12,47±0,92a,б

20,05±2,01a,б

26,28±2,15а,б

Примечание. Здесь и в табл. 2 представлены данные серий из 10–12 опытов. Исходное состояние – 30-минутная стабилизация гемодинамических показателей после препарирования животных. Контроль – 40-минутная окклюзия ПНА с последующей 60-минутной реперфузией. К-Мg-Асп, ГИК или И – 60-минутная реперфузия с соответствующим протектором со скоростью 1 мл/кг/час после 40-минутной окклюзии ПНА.
аp<0,01 по сравнению с исходным состоянием; бp<0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 2. Влияние реперфузии с метаболическими протекторами на содержание аминокислот, глюкозы и лактата в ЗР левого желудочка (M±m; мкмоль/г сухого веса ткани)

Группа

Аспартат

Глутамат

Лактат

Глюкоза

Исходное состояние (n=8)

6,75±0,56

23,45±2,12

2,15±0,14

2,46±0,29

Контроль (n=10)

0,46±0,11а

9,35±0,84а

12,83±1,80а

38,26±4,12а

К-Мg-Асп (n=12)

3,98±0,45а,б

16,27±0,90а,б

10,05±0,55а

26,30±2,74а,б

ГИК (n=8)

1,94±0,20а,б,в

12,92±0,98а,б

9,10±2,32а

92,22±19,58а,б,в

И (n=9)

2,87±0,24а,б,в

14,77±1,18а,б

8,50±0,85а

17,58±2,96а,б,в

Примечание: p<0,05 по сравнению, а – с исходным состоянием, б – с контролем, в – с К-Mg-Асп.

 

Рис. 1. Ограничение размеров ИМ левого желудочка сердца крысы под действием метаболических протекторов.
Здесь и на рис. 2: представлены данные серий из 10–12 опытов. Контроль – 40-минутная окклюзия ПНА с последующей 60-минутной реперфузией; ГИК, И, К-Мg-Асп и ГИКАсп – 60-минутная реперфузия с соответствующим протектором со скоростью 1 мл/кг/ч после 40-минутной окклюзии ПНА. *p<0,05 по сравнению с контролем.

Рис. 2. Влияние реперфузии с метаболическими протекторами на содержание общего креатина в ЗР левого желудочка сердца крысы. Общий креатин (SКР=ФКр+Кр) выражали в % к исходному содержанию в ЗР, которое составляло 59,26±1,96 мкмоль/г сухой ткани. p<0,05 по сравнению *с контролем, +с К-Mg-Асп.

 

 

 

Рис. 3. Корреляция между средними значениями потерь общего креатина (SКр) в ЗР и средними значениями отношения ИМ/ЗР в исследуемых группах. Представлены данные серий из 10–12 опытов. 1 – ГИК, 2 – И, 3 – К-Мg-Асп, 4 – контроль.

 

 

   Показатели кислотно-щелочного баланса артериальной крови контролировали на кислотно-щелочном газоанализаторе “ABL-30” (“Radiometer”) и поддерживали на физиологическом уровне в течение всего опыта.
   Протоколы опытов. По окончании препарирования животных и стабилизации в течение 30 мин гемодинамических показателей (исходное состояние) для создания региональной ишемии на 40 мин окклюзировали ПНА. Продолжительность последующей реперфузии составляла 60 мин. В течение всего периода реперфузии в яремную вену со скоростью 1 мл/кг/ч вводили физиологический раствор (контроль). Эффективность защиты ишемизированного миокарда с помощью метаболических протекторов оценивали в отдельных сериях опытов, вводя с той же скоростью во время реперфузии К-Мg-Асп (K-аспартат 2,6 М, Mg-(аспартат)2 2,75 М); ГИК (глюкоза 2,8 М, И 100 МЕ/л, K+ 0,1 М), ГИКАсп (глюкоза 2,8 М, И 100 МЕ/л, K-аспартат 0,1 М) или И (100 МЕ/л в физиологическом растворе). Оптимальное содержание компонентов в составе протекторов и их дозы введения были подобраны, исходя из имеющихся в литературе данных, и оценены в сериях предварительных опытов на используемой модели ИМ.
   Измерение размеров ИМ. Срезы ЛЖ толщиной около 1,5 мм инкубировали 10 мин в 1% растворе 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида, растворенном в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 при 37оС. Затем их взвешивали для определения общей массы ЛЖ. После подсушивания окрашенные срезы сканировали, размеры ИМ и ЗР определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу “Imagecal” [16]. В каждой группе рассчитывали отношения ЗР/ЛЖ и ИМ/ЗР (в %).
   Обработка ткани и анализ метаболитов. По окончании исходного состояния или периода реперфузии ткань ЗР ЛЖ быстро вырезали и замораживали в жидком азоте. Замороженные образцы ткани измельчали в холодной 6% HСlO4 (10 мл/г ткани) и гомогенизировали с помощью “Ultra-Turrax” T225 ("IKA-Labortechnik"). Затем их экстрагировали 20 мин во льду и центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин при 4oС. Супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7,40 и повторно центрифугировали при 4oС для удаления осадка KClO4. Безбелковые экстракты хранили замороженными до определения метаболитов. Сухой вес ткани определяли взвешиванием части осадка ткани после экстракции HClO4, высушенной при 110oС в течение ночи [17]. Концентрации АТФ, фосфокреатина (ФКр), креатина (Кр), аспартата (Асп), глутамата (Глу), лактата и глюкозы определяли спектрофотометрически энзиматическими методами [18].
   Статистическая обработка. Данные представляли как M±m. Отличия между группами оценивали по t-критерию Стьюдента, различия между величинами считали достоверными при p<0,05.

Результаты
   
Влияние протекторов на размеры ИМ. Введение физиологического раствора или метаболических протекторов во время реперфузии не влияло на АД и кислотно-щелочное состояние артериальной крови. Во всех группах эти показатели в конце реперфузии не отличались от исходных значений и составляли в среднем: АД – 100±3 мм рт. ст., рН – 7,40±0,03; pCO2 – 24,5±1,8 мм рт. ст., PO2 – 299±30 мм рт. ст. Таким образом, животные всех групп были гемодинамически стабильны, и поддерживался адекватный аэробный обмен.
   В экспериментальных группах отношение ЗР/ЛЖ не отличалось от аналогичного показателя в контроле и в среднем составляло 24,2±1,3%, что указывало на стандартное повреждение миокарда при окклюзии ПНА. Отношение ИМ/ЗР составляло 55,5±3,9% в контроле и достоверно снижалось под влиянием всех протекторов (рис. 1). Размеры ИМ в экспериментальных группах, оцененные по этому показателю, снижались в ряду ГИКАсп> К-Мg-Асп>И>ГИК. Существенно, что достоверных различий в размерах ИМ после реперфузии ГИК или И не обнаружено. Это свидетельствует о том, что И играет ключевую роль в защитном эффекте ГИК. Замена К+ в смеси ГИК эквимолярным количеством К-аспартата (0,1 М) не приводила к дальнейшему ограничению размеров ИМ по сравнению с этим показателем в группе ГИК. Отношение ИМ/ЗР (в %) в группе ГИКАсп было самым высоким, но достоверно ниже, чем в контроле, поэтому исследование влияния ГИКАсп на метаболизм ЗР не проводили.
   Изменения в метаболическом состоянии ЗР. Содержание макроэргических фосфатов, аминокислот, глюкозы и лактата в ЛЖ сердца крысы до окклюзии ПНА (исходное состояние) соответствовало значениям, указанным в литературе (табл. 1, 2) [5, 8].
   Под влиянием региональной ишемии и последующей реперфузии содержание АТФ и ФКр в ЗР в контроле снижалось до 23,5±2,7 и 31,7±3,6% от исходного соответственно (см. табл. 1). В конце реперфузии содержание макроэргических фосфатов в ЗР сердец, защищенных ГИК, И или К-Мg-Асп, было в 2,5 раза выше, чем в контроле, и в среднем соответствовало 56,3±3,4 и 81,8±7,9% от исходных значений для АТФ и ФКр соответственно. Достоверных различий в содержании АТФ или ФКр в ЗР между экспериментальными группами не обнаружено.
   Низкое содержание АТФ и ФКр в ЗР в контрольной группе в конце реперфузии соответствовало метаболическим сдвигам, характерным для неэффективного восстановления аэробного обмена. К ним относятся высокое содержание продуктов гликолиза/гликогенолиза – лактата и глюкозы в ЗР к концу опыта и сниженное содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот (до 6,8±1,6 и 41,1±3,6% от исходных значений соответственно), указывающее на их включение в анаэробный обмен.
   Под влиянием реперфузии с метаболическими протекторами потери фонда аспарагиновой и глутаминовой кислот в ЗР достоверно снижались. Наибольшее содержание как аспарагиновой, так и глутаминовой кислоты в ЗР было отмечено при использовании К-Мg-Асп. В этом случае общий фонд этих аминокислот был в 2 раза выше, чем в контроле, и составлял 67,2±6,6 и 33,5±4,9% от исходного уровня соответственно (p<0,01). Это предполагало транспорт аспарагиновой кислоты в кардиомиоциты и ее последующее трансаминирование в глутаминовую кислоту. Накопление лактата и глюкозы в ЗР уменьшалось в наибольшей степени под влиянием И, что свидетельствовало об активации аэробного гликолиза. При реперфузии с ГИК содержание глюкозы в ЗР было наибольшим, что отражало увеличение не только внутриклеточного, но и внеклеточного содержания глюкозы, а уровень лактата был практически таким же, как и после реперфузии с И. Реперфузия с К-Мg-Асп также достоверно снижала уровни глюкозы и лактата в ЗР по сравнению с контролем.
   Целостность мембран кардиомиоцитов в ЗР оценивали по внутриклеточному маркеру – содержанию общего Кр (SКр=ФКр+Кр). В конце реперфузии этот показатель был минимальным в контроле за счет трехкратного снижения уровня ФКр и Кр (табл. 1) и составлял 32,3±2,3% от исходного содержания SКр (рис. 2). Под влиянием протекторов тканевой фонд SКр сохранялся значительно лучше, чем в контроле. После реперфузии с ГИК и И содержание SКр в ЗР составляло 80,1±4,9 и 78,2±5,6% от исходного уровня соответственно и было достоверно более высоким, чем у крыс группы К-Мg-Асп (63,3±5,5%; p<0,05). Поскольку мембрана интактных кардиомиоцитов непроницаема для ФКр и Кр [19], более высокое содержание SКр предполагает лучшую интегрированность сарколеммы кардиомиоцитов в ЗР при реперфузии с ГИК и И, чем К-Мg-Асп.
   Корреляционный анализ выявил тесную положительную взаимосвязь между средними значениями потерь общего креатина в ЗР (DSКр в % от исходного содержания) и средними значениями отношений ИМ/ЗР (в %) в исследуемых группах (r=0,99; p<0,05; рис. 3). Таким образом, под влиянием протекторов при большем ограничении размеров ИМ лучше сохранялось содержание DКр в ЗР, а следовательно, и меньше были разрывы сарколеммы ишемизированных кардиомиоцитов.

Обсуждение
   
Эффективность протекторов при реперфузии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что внутривенное введение всех изучавшихся протекторов на реперфузии увеличивает толерантность постишемических кардиомиоцитов ЗР к реперфузионному повреждению по сравнению с изменениями в контроле. Наибольшее и практически одинаковое снижение необратимого повреждения, охарактеризованное отношением ИМ/ЗР (в %), обеспечивала ранняя реперфузия ГИК и И, в меньшей степени ИМ снижался под действием К-Мg-Асп (см. рис. 1). Включение аспартата К в состав ГИК не увеличивало кардиопротекторную эффективность ГИК. Отсутствие дополнительного защитного эффекта, вероятно, связано как с низким содержанием самого Асп в составе ГИКАсп по сравнению с его содержанием в К-Мg-Асп, так и с отсутствием второго необходимого компонента для проявления протекторных свойств Асп – Мg2+.
   Полученные данные непосредственно указывают на метаболическую природу защитного действия использованных реперфузионных составов: ГИК, И и К-Мg-Асп улучшали восстановление аэробного обмена в постишемических кардиомиоцитах. Это подтверждалось более высоким содержанием АТФ и ФКр, лучшим сохранением фонда ключевых аминокислот сердца – Асп и Глу – одновременно со снижением накопления лактата в ЗР в конце реперфузии (см. табл. 1, 2). Также нами была обнаружена тесная корреляция между сохранением содержания SКр в ЗР и снижением размеров ИМ во всех группах (см. рис. 3). В целом восстановление аэробного обмена и уменьшение повреждения мембран кардиомиоцитов, оцененное по содержанию SКр, было максимальным в группах И и ГИК и незначительно ниже после реперфузии К-Мg-Асп. Таким образом, метаболическая эффективность протекторов соответствовала ограничению размеров ИМ и увеличивалась в ряду контроль<К-Мg-Асп<И<ГИК.
   Механизмы защитного действия ГИК. Особый интерес представляет анализ влияния ГИК и И на снижение гибели кардиомиоцитов в ЗР. Ранее защитные механизмы «поляризующей смеси» ГИК связывали с обеспечением электрической стабильности сердца при ишемии [20]. Впоследствии L.Opie и соавт. была разработана метаболическая концепция действия ГИК, основанная на регуляции энергетического обмена [21]. На разных моделях ишемии и реперфузии миокарда было подтверждено, что под влиянием ГИК увеличивается продукция АТФ в гликолизе, лучше сохраняются запасы гликогена, происходит образование пирувата, сопряженное с обеспечением физиологических уровней интермедиатов цикла трикарбоновых кислот [6]. Следствием этого является большая интегрированность плазматических мембран и поддержка ионного гомеостаза кардиомиоцитов. Принципиально важно, что ГИК способен оптимизировать утилизацию энергопродуцирующих субстратов ишемизированным сердцем, снижая уровень циркулирующих в крови СЖК и их захват миокардиальными клетками [22]. В экспериментальных работах и у пациентов, подвергавшихся реваскуляризации коронарных артерий, были обнаружены тесные взаимосвязи между увеличенной экстракцией миокардом глюкозы, метаболическими эффектами ГИК и снижением постишемической дисфункции сердца [10, 23]. Совокупность этих результатов принципиально согласуется с ограничением ИМ при использовании ГИК в период реперфузии, продемонстрированным нами и другими исследователями [6, 11, 13, 14]. Очевидно, что факторами, определяющими уменьшение гибели кардиомиоцитов в ЗР, являются снижение ингибирующего действия СЖК на энергетический обмен, увеличение продукции АТФ при окислении глюкозы, меньшее накопление лактата и H+, инициирующее перегрузку ионами Ca2+, и развитие дефектов сарколеммы.
   Полученные нами результаты показывают, что основным кардиозащитным компонентом ГИК является И. Это подтверждается как одинаковым снижением размеров ИМ под действием ГИК и одного И (см. рис. 1), так и их сходным влиянием на показатели энергетического обмена, продукцию лактата и содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот в ЗР (см. табл. 1, 2). Более того, введение в состав ГИК еще одного потенциального кардиопротектора – Асп – при замене К+ эквимолярным количеством К-аспартата (ГИКАсп) не вызывало дальнейшего уменьшения ИМ (см. рис. 1). Это позволяет предположить, что снижение реперфузионного повреждения ЗР под влиянием ГИК прямо не связано с захватом ишемизированными миоцитами глюкозы или К+ и может быть обусловлено независимыми кардиопротекторными механизмами. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что ГИК в равной степени снижал размеры ИМ у крыс in vivo при внутривенном введении в период ишемии и реперфузии и при введении только во время реперфузии [12]. Однако в последнем случае изменений в содержании СЖК и глюкозы в крови по сравнению с контролем не происходило.
   Активация метаболических и сигнальных путей И. В опытах на изолированном перфузируемом сердце крысы и на животных разных видов in vivo показано, что реперфузия одним И способна восстанавливать функцию сердца и уменьшать размеры ИМ, вызванные ишемическим и реперфузионным стрессом, практически в той же степени, что и ГИК [11, 12]. Эти данные хорошо согласуются с результатами настоящей работы (см. рис. 1). Имеются экспериментальные и клинические подтверждения того, что это может быть вызвано ингибированием И липолиза в жировой ткани, приводящим к снижению концентрации СЖК в крови и уменьшению их экстракции миокардом [24]. Сдвиг в утилизации энергетических субстратов под действием И в пользу углеводов уменьшает бесполезный расход АТФ при включении СЖК в триглицериды и снижает ингибирование окисления глюкозы ацетилкоэнзимом А и цитратом – продуктами окисления СЖК. Следствием этих метаболических перестроек является меньшее повреждение функции митохондрий и накопление Н+ в постишемических кардиомиоцитах, способствующее сохранению внутриклеточного ионного гомеостаза и целостности плазматических мембран [7, 9, 14]. Прямые доказательства улучшения восстановления аэробного метаболизма в ЗР и снижение повреждений мембран кардиомиоцитов под действием И были получены в данной работе (см. табл. 1, 2).
   В то же время ранее было экспериментально подтверждено, что И промотирует внутриклеточные сигнальные пути выживания ишемизированных кардиомиоцитов при реперфузии. Так, на модели изолированного сердца крысы показано, что инфузия И на стадии ранней реперфузии уменьшает не только некроз, но и запрограммированную гибель клеток – апоптоз [11, 25]. Причем антиапоптозное действие И не зависит от энергетического субстрата и полностью воспроизводится при замене глюкозы в перфузате пируватом. С помощью ингибиторного анализа было доказано, что этот кардиопротективный фенотип опосредуется сигнальными каскадами, в которых участвуют тирозинкиназа, фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3-киназа) и p70S6-киназа (S6K), а активация сигнальных интермедиатов – протеинкиназы B (Akt) и S6K – происходит при их фосфорилировании И в стадию реперфузии [12]. Кроме того, И при реперфузии поддерживает проапоптозный пептид BAD (Bcl-2/Bcl-XL – агонист, вызывающий гибель клеток) в неактивной фосфорилированной форме. В последние годы был идентифицирован дополнительный сигнальный каскад, инициируемый И в реперфузируемом сердце, мишенью которого является эндотелиальная NO-синтаза [26]. Фосфорилирование этого фермента И через опосредованный PI3-киназой – Akt путь вызывает образование в эндотелии NO, обладающего свойствами не только вазодилататора, но и ингибитора апоптоза [27]. Таким образом, митоген И может действовать как "метаболически независимый" компонент коктейля ГИК, снижая вклад апоптоза в реперфузионное повреждение миокарда.
   Особенности действия К-Мg-Асп. Хотя целесообразность применения аспарагиновой кислоты при остром ИМ давно обоснована экспериментально [3, 28], данные по влиянию К-Мg-Асп на ИМ и метаболизм ЗР в доступной литературе отсутствуют. Механизм его действия связывают с ролью аниона Асп2- как переносчика ионов K+ и Mg2+ во внутриклеточное пространство и участием самого Асп2- в метаболических процессах. Благодаря этому К-Мg-Асп способен уменьшать дисбаланс электролитов, снижать возбудимость и проводимость миокарда, оказывая антиаритмический эффект, и улучшать метаболическое состояние постишемического сердца. Полученные нами результаты показывают, что ограничение размеров ИМ под действием К-Мg-Асп при реперфузии прямо связано с его включением во внутриклеточный обмен. Это подтверждается значительным снижением потерь аспарагиновой кислоты в ЗР к окончанию реперфузии и одновременным увеличением содержания продукта ее метаболизма – глутаминовой кислоты (см. табл. 2). Образование интермедиатов цикла трикарбоновых кислот и активация переноса восстановительных эквивалентов NADH из цитозола в митохондрии в малат-аспартатном челноке в результате сопряженного трансаминирования глутаминовой и аспарагиновой кислот способствует аэробному окислению глюкозы и восстановлению макроэргических фосфатов [3–5]. Об этом свидетельствуют достоверно более низкие уровни лактата и глюкозы (см. табл. 2) и двукратное увеличение содержания АТФ и ФКр в ЗР по сравнению с контролем (см. табл. 1). Кроме того, изменение трансмембранных ионных потоков, вызванное введением К-Мg-Асп, влияет на активность фосфоинозитидной и аденилатциклазной систем в миокарде [2]. Поскольку обе мессенджерные системы находятся в центре влияния гормонов и биологически активных веществ, “быстрые ответы” кардиомиоцитов, обусловленные изменениями мембранных потенциалов, также могут быть ответственны за предотвращение гибели постишемических кардиомиоцитов.

Заключение
   
Тромболитическая терапия или первичная ангиопластика являются стандартной помощью при остром ИМ. Очевидно, что восстановления коронарного кровотока и снабжения кислородом ЗР недостаточно для спасения постишемических кардиомиоцитов, и следующей мишенью терапевтического воздействия должен быть миокард, поэтому для успешной миокардиальной защиты в условиях срочной реперфузии необходимо использовать метаболические протекторы. Это, в частности, подтверждают клинические исследования ECLA и DIGAMI, в которых продемонстрирована высокая кардиопротективная эффективность реперфузии ГИК, снижавшая смертность больных с острым коронарным синдромом [29, 30]. Результаты нашей работы, так же как и данные более ранних экспериментальных исследований, указывают на перспективность такого подхода. Применение метаболических протекторов позволяет снижать обе составляющие необратимого повреждения миокардиальных клеток – некроз и апоптоз. Это достигается комплексным воздействием на внутриклеточный обмен и ионный гомеостаз модуляцией активности сигнальных каскадов и мессенджерных систем. Полученные результаты указывают на целесообразность дальнейшего изучения действия этого класса кардиопротекторов в условиях реперфузионного стресса.
   

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №05-04-48524).

Литература
1. Verma S, Fedak PWM, Eeisel RD. Fundamentals of reperfusion injury for the clinical cardiologist.
Circulation 2002; 105: 2332–6.
2. Вишневский А.А., Берляков А.А. Активность мессенджерных систем в гипертрофированном миокарде крыс при введении панангина. Бюл. экспер. биол. и мед. 2002; 134 (9): 299–302.
3. Rosenfeldt FL, Korchazhkina OV, Richards SM et al.
Aspartate improves recovery of the recently infarcted rat heart after cardioplegic arrest. Eur J Cardio-Thorac Surg 1998; 14: 185–90.
4. Snaith ChD, Wright G, Lofkin M. The effects of aspartate and 2-oxoglutarate upon glycolytic energy metabolites and mechanical recovery following global ischemia in isolated rat heart. J Mol Cell Cardiol 1992; 24: 305–15.
5. Pisarenko OI. Metabolic and antioxidant support with amino acids. Ischemia-reperfusion injury in cardiac surgery. Georgetown, Landes Bioscience, 2001; 90–6.
6. Apstein CS, Taegtmeyer H. Glucose-insulin-potassium in acute myocardial infarction. The time has come for a large, prospective trial. Circulation 1997; 95: 1074–7.
7. Lopaschuk GD, Wambolt RR, Barr RI. An imbalance between glycolysis and glucose oxidation for the detrimental effects of high levels of fatty acids during aerobic reperfusion of ischemic hearts. J Pharmacol Exp Ther 1993: 264: 135–44.
8. Cross HR, Radda GK, Clarke K. The role of Na+/K+-ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury: a 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopy study. Magn Reson Med 1995; 34: 673–85.
9. Xu KY, Zweier JL, Becker LC. Functional coupling between glycolysis and sarcoplasmic reticulum Ca
2+ transport. Circ Res 1995; 77: 88–97.
10. Jonassen AK, Aasum E, Reismersma RA et al. Glucose-insulin-potassium reduces infarct size when administrated during reperfusion. Cardiovasc Drugs and Therapy 2000; 14: 615–23.
11. Zhang HF, Fan Q, Qian XX, Lopez BL et al. Role of insulin in the apoptotic effect of glucose-insulin-potassium in rabbits with acute myocardial ischemia and reperfusion. Apoptosis 2004; 9: 777–83.
12. Jonassen AK, Sack MN, Mjos OD, Yellon DM. Myocardial protection by insulin at reperfusion requires early administration and is mediated via Akt and p70s6 kinase cell-survival signaling. Circ Res 2001; 89: 1191–9.
13. LaDisa JF, Krolikowski JG, Pagel PS et al. Cardioprotection by glucose-insulin-potassium: dependence on KATP channel opening and blood glucose concentration before ischemia. Am J Physiol (Heart Circ Physiol) 2004; 287: H601–7.
14. Angelos MG, Murray HN, Gorsline RT, Klawitter PF. Glucose, insulin and potassium (GIK) during reperfusion mediates improved myocardial bioenergetics.
Resuscitation 2002; 55(3): 329–36.
15. Писаренко О.И., Студнева И.М., Серебрякова Л.И. и др. Защита миокарда крыс селективным ингибитором Na
+/H+ обмена и ишемическим прекондиционированием. Кардиология 2005; 45 (2): 37–44.
16. Писаренко О.И., Серебрякова Л.И., Цкитишвили О.В. и др. Влияние ингибирования Na
+/H+ обмена на метаболизм зоны риска и размеры инфаркта миокарда у собак. Кардиология
. 2003; 12: 73–8.
17. Pisarenko OI, Tskitishvili OV, Studneva IM, Serebryakova LI. Metabolic effects of ischemic preconditioning and adenosine receptor blockade in dogs. Ann NY Acad Sci 1996; 793: 85–97.
18. Bergmeyer HU. Methods of enzymatic analysis. New York: Academic Press 1974; 3–4: 1464–7, 1696–700, 1704–8, 1772–6, 2101–10, 2127–31.
19. Reimer KA, Hill ML, Jennings RB. Prolonged depletion of ATP and of the adenine nucleotide pool due to delayed resynthesis of adenine nucleotides following reversible myocardial ischemic injury in dogs. J Mol Cell Cardiol 1981; 13: 229–39.
20. Sodi-Pallares D, Testelli M, Fishleder F. Effects of intravenous infusion of potassium-insulin-glucose solution on the electrocardiographic signs of myocardial infarction. Am J Cardiol 1962; 9: 166–81.
21. Opie LH. Glucose and the metabolism of ischaemic myocardium. Lancet 1995; 345: 1520–1.
22. Sidossis LS, Stuart CA, Shulman GI et al. Glucose plus insulin regulate the rate of fatty acid entry into the mitochondria. J Clin Invest 1996; 98: 2244–50.
23. Coleman GM, Gradinac S, Taegtmeyer H et al. Efficacy of metabolic support with glucose-insulin-potassium for left ventricular pump failure after aortocoronary bypass surgery. Circulation 1989; 80: 191–6.
24. Randle PJ. Regulatory interactions between lipids and carbohydrates: The glucose – fatty acid cycle after 35 years. Diabetes Metab Rev 1998; 14: 263–83.
25. Sack MN, Yellon DM. Insulin therapy as an adjunct to reperfusion after acute coronary ischemia. A proposed direct myocardial cell survival effect independent of metabolic modulation. J Am Coll Cardiol 2003; 41 (8): 1404–7.
26. Gao F, Gao E, Yue T-L. Et al. Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemia-reperfusion. The roles of PI3-kinase, Akt, and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation. Circulation 2002; 105: 1497–506.
27. Rakhit RD, Marberb MS. Nitric oxide: an emerging role in cardioprotection? Heart 2001; 86: 368–72.
28. Engelman RM, Rousou JA, Flack JE 3rd, et al. Reduction of infarct size by systemic amino acid supplementation during reperfusion. J Thorac Cardiovasc Surg 1991; 101 (5): 855–9.
29. Diaz R, Paolasso EA, Piegas LS et al. Metabolic modulation of acute myocardial infarction: The ECLA glucose-insulin-potassium pilot trial. Circulation 1998; 98 (21): 2227–34.
30. Malmberg K, Ryden L, Hamsten A et al. Ettects of insulin treatment on cause-specific one-year mortality and morbidity in diabetic patients with acute myocardial infarction: DIGAMI study group: Diabetes insulin-glucose in acute myocardial infarction.
Eur Heart J 1996; 17: 1337–44.



В начало
/media/cardio/07_02/24.shtml :: Sunday, 18-Nov-2007 22:09:39 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster