Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 02/N 2/2007 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Лентивирусная трансдукция малодифференцированных костно-мозговых клеток-предшественников in vivo


Н.В.Радюхина, П.Н.Руткевич, Т.И.Арефьева, А.В.Козлов, Т.Х.Гурская, А.Я.Шевелев, И.Н.Рыбалкин, Т.Н.Власик, О.П.Ильинская, Э.М.Тарарак

Институт экспериментальной кардиологии

Цель исследования. Создание эффективного способа переноса генов в недифференцированные клетки костного мозга методом лентивирусной трансдукции in vivo.
Материалы и методы. Выделенные с помощью метода магнитной сепарации клетки костного мозга мыши с фенотипом Lin
-c-kit+ трансдуцировали с помощью лентивирусного вектора, содержащего маркерный ген, кодирующий зеленый флюоресцентный белок (сорGFP). Долю клеток, экспрессирующих трансген, оценивали на поточном цитофлюорометре. Трансдуцированные in vitro донорские клетки самца вводили летально облученным самкам-реципиентам для получения селезеночных колоний. Интеграцию генетической конструкции в костно-мозговые клетки-предшественники in vivo контролировали по наличию в геномной ДНК клеток селезеночных колоний векторной последовательности WPRE (woodchuck post-transcriptional regulatory element). Стабильность интеграции генетической конструкции в геном клеток-мишеней оценивали на культуре фибробластов линии NIH3T3, которые культивировали в течение 3 мес после трансдукции.
Результаты. Предложенная генетическая конструкция позволила добиться высокой эффективности трансдукции малодифференцированных клеток костного мозга и обеспечила высокий (27%) уровень экспрессии трансгена in vitro. В экспериментах по получению селезеночных колоний у летально облученных животных было показано, что часть селезеночных колоний содержала трансген, и, следовательно, используемая генетическая конструкция была интегрирована в геном клеток-потомков донорских клеток. Среди донорских костно-мозговых клеток-предшественников, содержащих трансген, присутствовали колониеобразующие единицы, которые способны формировать селезеночные колонии, в том числе недифференцированного типа, у летально облученных животных.
Заключение. Выбранная генетическая конструкция, полученная на основе лентивируса HIV, способна эффективно и стабильно трансдуцировать костно-мозговые клетки-предшественники с фенотипом Lin
-c-kit+ in vivo.
Ключевые слова: костно-мозговые клетки-предшественники, лентивирусные векторы, трансдукция, селезеночные колонии.

N.V. Radyukhina, P.N. Rutkevich, T.I. Arefyeva, A.V. Kozlov, T.Kh. Gurskaya,
A.Ya. Shevelev, I.N. Rybalkin, T.N. Vlasik, O.P. Ilyinskaya, E.M. Tararak

Institute of Experimental Cardiology

IN vivo lentivirus transduction of low-differentiated bone marrow
cell progenitors

Aim. To develop an effective procedure for gene transfer to undifferentiated bone marrow cells by ex vivo lentivirus transduction.
Materials and methods. The bone marrow cells of a mouse with the phenotype Lin
-c-kit+, isolated by magnetic separation, were transduced using the lentivirus vector containing a marker gene encoding for green fluorescent protein (cop GFP). The proportion of transgene-expressing cells was estimated on a flow cytofluorometer. The in vitro transduced male donor cells were administered to the lethally irradiated female recipients to obtain splenic colonies. The in vivo integration of the genetic make-up into the bone marrow cell progenitors was monitored by the presence of the cells of splenic colonies of the vector sequence WPRE (woodchuck post-transcriptional regulatory element) in genomic DNA. The stability of integration of the genetic make-up into the genome of target cells was evaluated on a culture of NIH3T3 fibroblasts that had been cultured within 3 months after transduction.
Results. The proposed genetic make-up has ensured a high efficiency of transduction of low-differentiated bone marrow cells and a high (27%) level of transgene expression in vitro. The experiments to obtain splenic colonies in lethally irradiated animals demonstrated that the portion of splenic colonies contained transgene and therefore the used genetic make-up was integrated into the genome of donor cell progenitors. Among the transgene-containing donor bone marrow cell progenitors, there were colony-forming units that were able to form splenic colonies, including those of the undifferentiated type, in lethally irradiated animals.
Conclusion. The chosen HIV lentivirus-based genetic make-up can effectively and stably transduce bone marrow cell progenitors with the phenotype Lin
-c-kit+ in vivo.
Key words: bone marrow cell progenitors, lentivirus vectors, transduction, splenic colonies.

В настоящее время перенос генов в кроветворные клетки-предшественники млекопитающих является перспективным и быстро развивающимся методом в биологии и медицине. Это стало возможным в связи с успехами в конструировании векторов, доставляющих гены, представляющие научный и лечебный интерес, в соответствующие клетки [1–3]. В качестве наиболее перспективных генетических конструкций для переноса генов в клетки-предшественники рассматриваются лентивирусные системы трансгенного переноса, в связи с их уникальной способностью доставлять гены в неделящиеся клетки, в том числе и в стволовые [4]. Однако пока максимально достигнутая эффективность трансдукции ранних костно-мозговых клеток-предшественников (КМКП) лентивирусными конструкциями незначительна и не превышает 20% [5, 6]. Низкая эффективность трансдукции (маркирования) таких клеток не позволяет получить полную картину их участия в развитии сосудистых патологий, реэндотелизации артериальной стенки или новообразований кровеносных сосудов.
   Целью исследования являлась разработка оптимального способа переноса генов в геном малодифференцированных клеток костного мозга (КМ) с помощью лентивирусной трансдукции in vivo. Проводили сравнительный анализ двух генетических конструкций, полученных на основе лентивирусов кошачьего (FIV) и человеческого (HIV-1) иммунодефицитов, по их способности трансдуцировать КМКП мыши. В качестве репортерного использовали ген зеленого флюоресцентного белка (copGFP), позволяющий оценить эффективность трансдукции in vitro и, в дальнейшем, проследить за изменениями меченых клеток in vivo. Интеграцию выбранной генетической конструкции в КМКП in vivo контролировали по наличию в геномной ДНК потомков этих клеток векторной последовательности WPRE с помощью метода селезеночных колоний.

Материалы и методы
   
В работе использовали самок и самцов мышей-гибридов (CBAґC57Bl/6) F1 массой 18–20 г.
   Получение препаратов псевдовирусных частиц. Для трансдукции КМКП апробировали два варианта генетических конструкций, созданных на основе FIV и HIV. В качестве репортерного обе конструкции содержали ген сорGFP под промотором человеческого цитомегаловируса (ЦМВ).
   Для получения псевдовирусных частиц на основе HIV, кроме транспортной плазмиды pLA-CG-H1 (“System Biosiences”), использовали две упаковочные плазмиды – pVSV-G и pHIVpack (“System Biosciences”).
   Для упаковки FIV-частиц использовали транспортную плазмиду pCopGXL-H1 (“System Biosiences”) и плазмиду pVSV-G-C34N, которая была объединена из двух плазмид – pVSV-G и pC34N (“System Biosiences”).
   Для получения псевдовирусных частиц были взяты клетки-“упаковщики” линии HEK293-Т, которые котрансфицировали препаратами плазмид с добавлением липофектамина. Полученные псевдовирусные частицы концентрировали с помощью полиэтиленгликоля. Титр частиц был определен на клетках культуры Н1299 и составил от 1,5ґ106 до 1ґ107 инфекционных частиц/мл.
   Выделение субпопуляции ранних клеток-предшественников КМ с фенотипом Linc-kit+. Для получения субпопуляции ранних КМКП применяли двухэтапный метод магнитной сепарации клеток с использованием магнитных микроносителей из коллоидного железа MACS MicroBeads в соответствии с протоколом производителя (“Miltenyi Biotec”).
   На I этапе от тотальной популяции клеток КМ отделяли клетки, не несущие на поверхности “линейные” маркеры. Для этого суспензию клеток КМ мыши окрашивали коктейлем моноклональных антител против маркеров разных направлений дифференцировки кроветворных клеток (CD5, CD45R, CD11b, Ly6G и Ter 119), конъюгированных с микроносителями. Клетки, не несущие на поверхности “линейные” маркеры, были отделены пропусканием клеточной суспензии через находящуюся в магнитном поле колонку LS Column (“Miltenyi Biotec”), заполненную ферромагнитным материалом.
   На II этапе из полученной субпопуляции выделяли клетки, несущие на поверхности рецептор к фактору стволовых клеток c-kit. Клетки, изолированные на I этапе, окрашивали антителами против c-kit, конъюгированными с микроносителями, и пропускали через колонку. Полученную популяцию КМКП подвергали субпопуляционному анализу на поточном цитофлюорометре FACSCalibur (“BD Immunocytometry Systems”) после окрашивания специфическими антителами против белков – маркеров стволовых и низкодифференцированных клеток: c-kit, Sca-1, CD34 (“BD Biosciences”).
   Трансдукция субпопуляции ранних костно-мозговых кроветворных клеток-предшественников с фенотипом Linc-kit+ in vitro. Для трансдукции свежевыделенные клетки с фенотипом Lin–c-kit+ высаживали в 24-луночный планшет в ростовую среду, содержащую 10% инактивированной нагреванием сыворотки, с добавлением цитокинов интерлейкина-3 (ИЛ-3), ИЛ-6 и фактора стволовых клеток. После внесения псевдовирусных частиц и полибрена (конечная концентрация – 5 мкг/мл) клетки инкубировали при 370С и 5% СО2 и через 24 ч отмывали и добавляли свежей среды.
   Для обеспечения наибольшей эффективности трансдукции КМКП in vitro сравнивали два варианта генетических конструкций, созданных на основе FIV и HIV, иммунодефицитов, по их способности к интеграции в геном этих клеток с последующей экспрессией встроившегося гена. После трансдукции псевдовирусными частицами с разными титрами клетки культивировали в течение 1 нед, а затем анализировали на поточном цитофлюорометре, определяя долю клеточных элементов, экспрессирующих GFP. Во время культивирования проводили также визуальную оценку цитотоксического эффекта, оказываемого псевдовирусными частицами.
   Трансдукция и культивирование фибробластов мыши линии NIH3T3. Для подтверждения способности выбранной генетической конструкции эффективно и стабильно встраиваться в геном клеток-мишеней, а также экспрессировать введенный трансген, трансдуцировали фибробласты мыши (линия NIH3T3). Выбор объекта для данного эксперимента был обусловлен тем, что эти клетки, в отличие от клеток переживающей культуры КМ, можно легко культивировать в течение длительного периода времени.
   Для трансдукции мышиные фибробласты линии NIH3T3 высаживали в 6-луночный планшет, в ростовую среду DMEM, содержащую 10% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы.
   После внесения препарата псевдовирусных частиц, полученного на основе HIV и полибрена (конечная концентрация 5 мкг/мл) клетки инкубировали при 37оС и 5% СО2, затем через 48 ч отмывали и культивировали в течение 3 мес. Часть клеток 1 раз в неделю брали для анализа. Долю клеточных элементов, экспрессирующих GFP, оценивали на поточном цитофлюорометре. Наличие фрагмента векторного генома в ДНК, выделенной из этих клеток, а также количество встроившихся копий векторной последовательности на 1 клетку определяли с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).
   Тестирование результатов трансдукции КМКП in vivo. Получение селезеночных колоний. Для контроля интеграции выбранного вектора в геном недифференцированных клеток КМ in vivo использовали метод получения селезеночных колоний. Для получения селезеночных колоний гибридных самок (CBAґC57Bl/6)F1 облучали двумя равными дозами с перерывом в 3 ч на 137Cs-установке ИПК. Общая доза облучения составила 10 Гр. После облучения самкам-реципиентам внутривенно вводили суспензию трансдуцированных клеток КМ самцов той же линии. В качестве контрольных использовали 2 группы животных, которым вводили нетрансдуцированные клетки с фенотипом Lin–c-kit+ или нативные клетки нефракционированного КМ. Всем животным вводили донорские клетки в количестве, необходимом для получения дискретных селезеночных колоний. Дозы введенных клеток и характеристика групп экспериментальных животных представлены в таблице.
   На 10-е сутки после облучения из селезенок изолировали отдельные колонии, из клеток которых выделяли геномную ДНК. Выделенную ДНК анализировали с помощью ПЦР для выявления двух маркерных фрагментов ДНК. Наличие одного из них – фрагмента ДНК Y-хромосомы – подтверждало донорскую природу клеток колоний, а другого – фрагмента векторной последовательности WPRE – интеграцию лентивирусной конструкции в ДНК клеток.
   Для подтверждения донорской природы колоний использовали праймеры, специфичные для Y-региона самцов: прямой (AAG TTG GCC CAG CAG AAT) и обратный (CTC CGA TGA GCC TGA TAT) [7]. Для выявления фрагмента векторной последовательности WPRE использовали праймеры фирмы "System Biosiences". ПЦР-продукты, полученные в результате амплификации ДНК, разделяли электрофорезом в агарозном геле.
   Часть селезенок с колониями фиксировали смесью Буэна, обезвоживали, заливали в парафин, получали парафиновые срезы, которые окрашивали гематологическим красителем Гимзы ("Sigma") и анализировали под микроскопом.

Рис. 1. Экспрессия GFP в культуре, образованной клетками КМ с фенотипом Lin-c-kit+, трансдуцированными псевдовирусными
HIV – частицами, на 7-е сутки культивирования (
ґ150).
а – фазовый контраст; б – флюоресцентная микроскопия.

Таблица. Характеристика групп экспериментальных животных

Группа самок- реципиенток

Донорские клетки самцов

Число введенных клеток

Инкубация с псевдовирусными частицами (трансдукция)

1-я (опыт; n=8)

Lin-c-kit+

2ґ103

+

2-я (контроль; n=4)

Lin-c-kit+

2ґ103

3-я (контроль; n=4)

Клетки нефракционированного КМ

3ґ104

Примечание. n – число животных в группе.

Рис. 2. Результат анализа на поточном цитофлюорометре суспензии клеток КМ с фенотипом Lin-c-kit+ через 7 сут после трансдукции генетической конструкцией на основе лентивируса HIV-1.
а – контроль (нетрансдуцированные клетки); б – опыт (трансдуцированные клетки). Интенсивность флюоресценции указана в условные единицы флюоресценции.



Рис. 3. Экспрессия GFP фибробластами линии NIH3T3 на 45-е сутки культивирования после трансдукции генетической конструкцией на основе лентивируса HIV-1 (
ґ150).
а – фазовый контраст; б – флюоресцентная микроскопия.



Рис. 4. Макроскопически различимые колонии (указаны стрелками) в селезенках летально облученных самок-реципиентов на 10-е сутки после трансплантации 2
ґ103 трансдуцированных клеток КМ с фенотипом Lin-c-kit+
самцов-доноров.




Рис. 5. Гистологическое исследование селезенок самок-реципиентов через 10 сут после трансплантации донорских клеток КМ самца.
а – селезенка мыши контрольной группы (вводили клетки нефракционированного КМ): видны эритроидные колонии. Окраска гематоксилин-эозином (
ґ40). На врезке – фрагмент эритроидной колонии (ґ200); б – селезенка мыши опытной группы (вводили трансдуцированные клетки КМ субпопуляции Lin-c-kit+): видна колония недифференцированного типа. Окраска гематологическим красителем Гимзы (ґ40). На врезке – фрагмент колонии (ґ600).



Рис. 6. Результат ПЦР-анализа ДНК клеток селезеночных колоний одной из мышей опытной группы на Y-хромосомный маркер (а) и фрагмент векторной последовательности WPRE (б).
Электрофорез продуктов амплификации последовательностей ДНК в агарозном геле. 1–5 – номера колоний.


Результаты и обсуждение
   
После выделения субпопуляции КМКП с фенотипом Lin–c-kit+ методом магнитной сепарации ее клеточный состав анализировали на поточном цитофлюорометре. Внутри этой популяции выявлены полипотентные КМКП с фенотипом Lin-c-kit+Sca-1+CD34+ (0,4–1,0%), которые, по данным литературы, способны давать клетки всех направлений кроветворной дифференцировки [8].
   При сравнительном исследовании эффективности двух вариантов генетических конструкций оказалось, что среди клеток, трансдуцированных псевдовирусными FIV-частицами, доля экспрессирующих GFP составила 8–27%. Практически аналогичные результаты были получены и при использовании генетический конструкции, созданной на основе HIV, в результате переноса которой клеток, экспрессирующих трансген, оказалось от 2,5 до 27%.
   При исследовании с помощью фазово-контрастной и флюоресцентной микроскопий, в тех случаях, когда удавалось добиться большой эффективности трансдукции КМКП FIV-частицами, в культуре наблюдали большое количество клеточного детрита, и лишь изредка встречались конгломераты созревающих кроветворных клеток. Заметный токсический эффект на клетки оказывали также псевдовирусные частицы, созданные на основе вируса HIV, с титром 1ґ107 инфекционных частиц/мл.
   HIV-частицы с титром 2ґ106 инфекционных частиц/мл не только позволили добиться высокой (27%) эффективности трансдукции, но и оказывали минимальный цитотоксический эффект in vitro. Культура КМКП, трансдуцированных этими частицами, почти не отличалась от таковой, не подвергшейся заражению (рис. 1 а, б).
   Результаты анализа этих клеток на поточном цитофлюорометре представлены на рис. 2 а, б.
   Таким образом, в результате сравнительного анализа эффективности двух разных систем трансдукции, для дальнейших экспериментов in vivo был выбран препарат псевдовирусных HIV-частиц с титром 2ґ106 на 1 мл.
   При проведении еженедельного цитофлюорометрического анализа было показано, что доля флюоресцирующих клеток фибробластов мыши линии NIH3T3 составила 92% и практически не изменялась в течение всего периода длительного культивирования. В течение первых 15 сут эксперимента интенсивность флюоресценции увеличивалась, что, по-видимому, свидетельствовало о накоплении белка в клетках. В дальнейшем показатели интенсивности флюоресценции вышли на плато и оставались практически без изменений до конца культивирования. Экспрессия маркерного белка GFP трансдуцированными фибробластами представлена на рис. 3.
   Количественный ПЦР-анализ ДНК, выделенной из трансдуцированных клеток линии NIH3T3, показал, что число встроенных копий векторной последовательности составило 5–7 на 1 клетку и практически не изменялось в течение всего периода культивирования.
   Таким образом, анализируя результаты данной части эксперимента, можно заключить, что вектор, созданный на основе лентивируса HIV, способен эффективно и стабильно трансдуцировать фибробласты линии NIH3T3.
   При тестировании результатов трансдукции КМКП in vivo методом селезеночных колоний было выявлено, что пролиферация в селезенке введенных кроветворных клеток приводит к образованию в ней очагов кроветворения (колоний), отчетливо визуализирующихся через 10 дней после трансплантации (рис. 4).
   Гистологическое исследование селезенок мышей 3-й группы (см. таблицу), которым после облучения вводили клетки нефракционированного КМ, позволило обнаружить все характерные типы селезеночных колоний: эритроидные (рис. 5, а), миелоидные, мегакариоцитарные и смешанные, что соответствует данным литературы [9].
   Среди селезеночных колоний мышей 1-й и 2-й групп (см. таблицу) значительная часть была представлена колониями недифференцированного типа, состоящими из морфологически неидентифицируемых лимфоцитоподобных и бластных элементов (рис. 5, б).
   Анализ результатов этой части эксперимента позволил сделать вывод о том, что при выделении КМКП с фенотипом Lin–c-kit+ произошло значительное обогащение субпопуляции ранними кроветворными клетками-предшественниками.
   Для подтверждения донорской природы колоний, образующихся в селезенке самок-реципиентов, выделенную из них ДНК исследовали на наличие фрагмента Y-хромосомы самца. Оказалось, что ДНК клеток колоний как опытной, так и обеих контрольных групп животных содержала фрагмент Y-хромосомы (рис. 6, а). Это свидетельствовало о том, что все колонии самок-реципиентов произошли из КМКП самцов-доноров.
   Кроме того, ДНК клеток колоний животных опытной группы анализировали на присутствие в геноме векторной последовательности WPRE. Было показано, что клеточные элементы в 30% колоний селезенок самок-реципиентов содержали этот фрагмент (рис. 6, б). Полученный результат свидетельствует о том, что используемая генетическая конструкция была интегрирована в геном клеток-потомков КМКП донорского происхождения.
   Заключение
   В результате проведенного исследования было показано, что генетическая конструкция, созданная на основе лентивируса HIV, in vitro способна эффективно трансдуцировать гемопоэтические клетки-предшественники с фенотипом Lin-c-kit+.
   Эксперименты по трансдукции фибробластов мыши линии NIH3T3 подтвердили стабильность интеграции генетической конструкции в геном клеток-мишеней с последующей экспрессией трансгена.
   Данные, полученные в результате переноса маркерного гена copGFP методом in vivo, свидетельствуют о наличии среди донорских КМКП колониеобразующих единиц, содержащих трансген и способных формировать селезеночные колонии, в том числе недифференцированного типа, у летально облученных животных.
   Результаты, полученные при выполнении настоящей работы, в дальнейшем предполагается использовать для уточнения этапов мобилизации из КМ клеток-предшественников эндотелия и гладкомышечных клеток артериальной стенки, их миграции через кровь и инвазии в область репарации. При последующем исследовании эти этапы, наряду с изучением пролиферации и дифференцировки КМКП в зрелые элементы стенки артерий, могут стать важными точками приложения стратегии генетической терапии сердечно-сосудистых заболеваний.
   

Исследование поддержано Госконтрактами Миннауки (№02.445.11.7486, 02.512.11.2049, 02.512.11.2129) и РФФИ (гранты №05-04-48922 и 07-04-01456).

Авторы выражают благодарность заведующей лабораторией физиологии крови Гематологического научного центра РАМН докт. биол. наук Н.И.Дризе за консультации и помощь в работе.

Литература
1. Lynch C.M., Clowes M.M., Osborne W.R. et al.
Long-term expression of human adenosine deaminase in vascular smooth muscle cells of rats: a model for gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89 (3): 1138–42.
2. Messina LM, Podrazik RM, Whitehill TA et al. Adhesion and incorporation of lacZ-transduced endothelial cells into the intact capillary wall in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89 (24): 12018–22.
3. Sata M. Role of circulating vascular progenitors in angiogenesis, vascular healing and pulmonary hypertension. Arterioscl Thromb Vasc Biol 2006; 26 (5): 1008–14.
4. Saenz DT, Poeschla EM. FIV: from lentivirus to lentivector. J Gene Med 2004; Suppl. 1: 95–104.
5. Chen WY, Wu X, Levasseur DN et al. Lentiviral transduction of hematopoietic stem cells that mediate long-term reconstitution of lethally irradiated mice. Stem Cells 2000; 18: 352–9.
6. Price MA, Case SS, Carbonaro DA et al. Expression from second-generation feline immunodeficiency virus vectors is impaired in human hematopoietic cells. Mol Ther 2002; 6 (5): 645–52.
7. Nagamine CM, Chan KM, Kozak CA, Lau YF. Chromosome mapping and expression of a putative testis-determining gene in mouse. Science 1989; 243 (4887): 80–3.
8. Osava M, Hanada K, Hamada H, Nakauchi H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34–low/negative hematopoietic stem cell.
Science 1996; 273 (5272): 242–5.
9. Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворения. М.: Медицина, 1977: 8–27.



В начало
/media/cardio/07_02/38.shtml :: Sunday, 18-Nov-2007 22:09:53 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster