Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Кардиологический вестник  
Том 02/N 2/2007 ПЕРЕДОВАЯ СТАТЬЯ

Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы


Е.В.Парфенова, В.А.Ткачук


E.V. Parfenova, V.A. Tkachuk
Therapeutic angiogenesis: advances, problems, prospects

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ее осложнения продолжают лидировать среди причин смерти в экономически развитых странах несмотря на значительный прогресс в контроле факторов риска и лечении, включая широкое распространение хирургических и эндоваскулярных методов реваскуляризации. В связи с этим разработка альтернативных методов улучшения кровоснабжения ишемизированных тканей остается актуальной. Терапевтический ангиогенез, который иногда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов. Толчок к интенсивному исследованию этих механизмов был дан более 30 лет назад Дж.Фолкнером, предложившим гипотезу о том, что прогрессирующее развитие злокачественных опухолей зависит от их васкуляризации [1]. Было показано, что опухоль продуцирует в большом количестве фактор, стимулирующий рост сосудов, который вскоре после этого Г.Д.Свет-Молдавский и К.Л.Чимишкян предложили использовать для реваскуляризации ишемизированного миокарда и лечения инфаркта миокарда (ИМ) [2]. Однако потребовалось около 20 лет интенсивных исследований, чтобы реализовать данное предложение. За эти годы были изучены молекулярные механизмы, регулирующие рост сосудов, выделены из опухолей основные ангиогенные факторы роста (ФР), выяснена их структура, получены рекомбинантные факторы и генетические конструкции с их генами. Со времени публикации первой работы по терапевтическому ангиогенезу в 1996 г. [3] прошло уже более 10 лет. За этот период времени было опубликовано более тысячи статей, посвященных данной проблеме. Огромный энтузиазм и надежды, вызванные многообещающими данными экспериментальных исследований и небольших, в основном неконтролируемых, клинических исследований, сменились разочарованием после получения результатов относительно больших двойных слепых плацебо-контролируемых клинических исследований, не подтвердивших однозначно эффективность этой тактики. В последние годы новые надежды были связаны с использованием стволовых клеток (СК) для терапевтического ангиогенеза и с данными экспериментальных исследований, свидетельствующими об ангиогенной эффективности различных ФР и их сочетаний, а также генетически модифицированных прогениторных клеток.   

Механизмы неоваскуляризации
   
Рост и образование сосудов в постнатальном периоде развития организма осуществляется через ангиогенез, артериогенез и васкулогенез. Ангиогенез представляет собой образование новых капилляров от посткапиллярных венул, которое осуществляется через активацию эндотелиальных клеток, экспрессию в них протеаз, деградацию внеклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию этих клеток, образование ими первичных высокопроницаемых сосудистых структур, последующую стабилизацию и "взросление" этих структур за счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток (ГМК) и организации их в сложную трехмерную сосудистую сеть [4]. Основным стимулом к ангиогенезу при физиологических и патологических состояниях является недостаток кислорода (гипоксия или ишемия), который через активатор транскрипции факторов ангиогенеза – индуцируемый гипоксией фактор-1 (HIF-1), индуцирует экспрессию многих ангиогенных факторов и прежде всего основного регулятора ангиогенеза как в эмбриональном, так и в постнатальном периоде развития организма – ФР эндотелия сосудов (VEGF) и его рецепторов. VEGF избирательно стимулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (ЭК), их предшественников и моноцитов, экспрессирующих рецепторы к нему, увеличивает сосудистую проницаемость, способствуя пропотеванию белков плазмы в околососудистое пространство, которое необходимо для миграции ЭК, индуцирует экспрессию эндотелиальной NO-синтазы и образование NO, что способствует вазодилатации и стимулирует экспрессию протеаз, разрушающих связи между ЭК и внеклеточным матриксом, что необходимо для направленной миграции клеток.
   В процессе стабилизации и “взросления” вновь образованной незрелой сосудистой сети участвуют: 1) ангиопоэтин-1, подавляющий пролиферацию ЭК, уменьшающий сосудистую проницаемость, способствующий привлечению перицитов; 2) тромбоцитарный ФР (PDGF), привлекающий перициты и ГМК; 3) трансформирующий ФР-бета 1 (TGF-beta 1), стимулируюший синтез белков матрикса. Процесс ангиогенеза строго регулируется ФР во времени и пространстве, и это необходимо учитывать при планировании тактики терапевтического ангиогенеза. В постнатальном организме стабильное состояние сосудов поддерживается балансом между активаторами ангиогенеза (в основном ФР и цитокинами) и его ингибиторами (тромбоспондином, ингибиторами матриксных металлопротеаз и активаторов плазминогена, эндостатином и др.), и сдвиг этого баланса в сторону активаторов, как правило, кратковременный, приводит к активации ангиогенеза, например, при воспалении, заживлении ран, ишемии. Недостаточный физиологический ангиогенез, обусловленный недостаточной продукцией ФР или экспрессией их рецепторов, либо увеличенной продукцией его ингибиторов, может способствовать нарастанию тяжести ишемических заболеваний (ИБС, хронической ишемии нижних конечностей). Ангиогенез приводит к увеличению плотности капиллярной сети в ишемизированных тканях и уменьшению периферического сосудистого сопротивления, что необходимо для обеспечения перфузии тканей, однако без артериогенеза он недостаточен для полноценной реваскуляризации. Артериогенез – формирование коллатеральных сосудов из нефункционирующих артериолярных соединений – представляет собой наиболее эффективный процесс реваскуляризации, обеспечивая кровоток в обход места окклюзии. Важнейшим стимулятором артериогенеза является увеличение напряжения сдвига выше места окклюзии, обусловленное увеличением кровотока, что способствует экспрессии молекул адгезии клетками эндотелия и последующей аккумуляции моноцитов в стенке сосуда, секретирующих большое количество ФР, из которых основными регуляторами артериогенеза являются ФР фибробластов (FGF), а также PDGF, VEGF и CXC-хемокины [5].
   Только у 25% больных со стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий при окклюзиях хорошо развиваются коллатеральные сосуды, что может быть обусловлено генетическими факторами [5]. Степень развития коллатеральных сосудов у больных ИБС тесно коррелирует с увеличением экспрессии HIF-1alpha моноцитами, взятыми от этих больных и помещенными в гипоксические условия [6], а также с экспрессией моноцитарного антигена CD44 [7]. Больные ИБС с хорошо развитыми коллатеральными сосудами характеризуются определенным фенотипом гаптоглобина и имеют более низкий уровень ингибитора ангиогенеза эндостатина в перикардиальной жидкости, чем пациенты с плохо развитыми коллатералями [8]. Все это указывает на индивидуальную вариабельность состояния естественных механизмов неоваскуляризации, вероятно, генетически детерминированных, что может влиять и на эффективность ангиогенной терапии.
   Васкулогенез – это формирование in situ кровеносных сосудов из прогениторных ЭК (ПЭК). Первоначально полагали, что истинный васкулогенез происходит только в эмбриональный период. Недавно ПЭК были выделены из периферической крови и костного мозга и получены доказательства их участия в формировании новых сосудов во взрослом организме, что изменило взгляд на васкулогенез, как на процесс, относящийся только к эмбриональному развитию [9]. Васкулогенез тесно ассоциирован с ангиогенезом и является обязательным участником формирования новых сосудистых отростков и неоваскуляризации, как физиологической (в ишемизированных тканях), так и патологической (в опухолях) [10–11]. Механизмы участия ПЭК в формировании новых сосудов включают несколько последовательных процессов: мобилизацию из костного мозга под влиянием ФР и цитокинов, образующихся в зонах ишемии, воспаления, злокачественного роста (GM-CSF, G-CSF, SDF-1,VEGF, Ang-1), направленную миграцию и аккумуляцию в зоне ишемии–повреждения и инкорпорирование в сосуды – "homing" [9, 11]. Функциональное значение васкулогенеза для восстановления коронарного или периферического кровоснабжения пока не определено, хотя имеется много экспериментальных доказательств участия ПЭК в процессах неоваскуляризации на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц. По обобщенным данным, доля этого участия, определяемая по степени инкорпорирования ПЭК в сосуды в зоне ишемии, варьирует от 3 до 40% [9].
   Цель терапевтического ангиогенеза – обеспечить реваскуляризацию ишемизированных тканей за счет стимуляции естественных процессов образования и роста сосудов. Стратегия ангиогенной терапии включает в себя снабжение этих тканей 1) экзогенными ФР в виде рекомбинантных белков или генетических конструкций, 2) стволовыми или прогениторными клетками, 3) мобилизацию эндогенных стволовых и прогениторных клеток из костного мозга или тканевого депо, а также сочетание этих воздействий.   

Терапевтический ангиогенез с факторами роста
   
В регуляции ангиогенеза участвует большое количество факторов. Ангиогенная эффективность многих из них показана на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц у животных, однако в клинических исследованиях основная доля приходится на VEGF и ФР фибробластов (FGF), являющихся представителями больших семейств ФР. Так, семейство ФР эндотелия сосудов представлено шестью факторами: VEGF-A (VEGF-1), VEGF-B (VEGF-3), VEGF-C (VEGF-2), VEGF-D, VEGF-E и PIGF, которые являются секретируемыми белками и связываются с тремя типами рецепторов: Flt-1 (VEGFR-1), Flk-2 (VEGFR-2), Flt-4 (VEGFR-3). VEGF-A, представленный 5 изоформами, состоящими из 121, 145, 165, 189 и 206 аминокислот, был идентифицирован первым, и изоформы VEGF-121 и VEGF-165 изучены наиболее хорошо как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях [12, 13].
   Из ФР фибробластов, представленных семейством, состоящим из 20 факторов, для терапевтического ангиогенеза использовали FGF-1 (aFGF), FGF-2 (bFGF) и FGF-4, связывающие гепаринсульфаты с высоким сродством и аккумулирующиеся во внеклеточном матриксе. FGF стимулируют пролиферацию и миграцию многих клеток, включая ГМК сосудов, и поэтому являются мощными индукторами артериогенеза. В экспериментальных исследованиях при введении FGF показан кардиопротективный эффект, связанный с подавлением апоптоза кардиомиоцитов (КМЦ), ангиогенный эффект, стимуляция ремоделирования сосудов и гипертрофии сердца [14–16].
   Возможность неоваскуляризации ишемизированных тканей с помощью VEGF и FGF доказана в многочисленных экспериментальных работах с помощью гистологических, ангиографических, радионуклидных методов на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц у грызунов (мыши, крысы, кролики), собак, свиней и овец [12–14]. Эти ФР использовали как в виде рекомбинантных белков, так и конструкций в плазмидном или аденовирусном векторе.
   Первые неконтролируемые клинические исследования у больных ИБС и больных с критической ишемией нижних конечностей (КИНК), в которых использовали рекомбинантные белки (VEGF-165, FGF-1 и FGF-2), дали весьма обнадеживающие предварительные результаты по эффективности. Однако данные двойных слепых плацебо-контролируемых исследований оказались менее оптимистичными [12, 13, 16]. В двух больших исследованиях, в которых тестировали внутрикоронарное введение рекомбинантных ФР (VEGF в исследовании VIVA у 178 больных ИБС, не являющихся оптимальными кандидатами для хирургической или эндоваскулярной реваскуляризации; FGF-2 в исследовании FIRST у 337 аналогичных больных) не удалось обнаружить различий с результатами в группах плацебо, так как и в контрольных, и в опытных группах отмечено значительное повышение толерантности к физической нагрузке ТФН (VIVA, FIRST) и перфузии миокарда (FIRST) через несколько месяцев после процедуры. Похожая ситуация возникла и в исследовании TRAFFIC (FGF-2 двукратно вводили в бедренную артерию больным с КИНК), в котором более выраженное увеличение времени безболевой ходьбы у получавших FGF-2 в первые 3 мес нивелировалось через 6 мес за счет увеличения времени безболевой ходьбы в группе получавших плацебо. Тем не менее результаты этого исследования вселили некоторый оптимизм относительно возможности использования рекомбинантного FGF-2 при КИНК.
   Внутримиокардиальное введение рекомбинантных FGF-1 и FGF-2 проводили во время аортокоронарного шунтирования (АКШ) [14, 15, 17]. Хотя оценка эффективности терапевтического ангиогенеза в сочетание с хирургической реваскуляризацией представляется очень сложной, а порой невозможной, исследование, в котором использовали FGF-2, заслуживает особого внимания. В этой работе (двойное слепое плацебо-контролируемое исследование) капсулы из гепариналгината, содержащие рекомбинантный FGF-2 или плацебо, вшивали под эпикард во время АКШ по ходу артерии, которую невозможно было шунтировать. Достоверно более выраженное улучшение перфузии миокарда в этой области зарегистрировано у больных, получивших капсулы с FGF-2. Причем положительный эффект этой процедуры регистрировался в течение 3 лет [17].
   Возможно, неудачи контролируемых исследований по терапевтическому ангиогенезу с помощью рекомбинантных ФР были обусловлены неправильно выбранным способом введения фактора. Рекомбинантные белки имеют короткий период полужизни в кровотоке, к тому же показано, что при внутрисосудистом способе введения очень небольшая часть белка задерживается в миокарде: 0,1% при внутривенном введении и 5% при внутрикоронарном [18]. Для эффективного использования рекомбинантных ФР необходимо их локальное введение в миокард или скелетные мышцы в виде комплексов с матриксными белками, обеспечивающими длительное локальное высвобождение фактора.
   Альтернативой терапии рекомбинантными белками может быть генная терапия. В отличие от рекомбинантных белков генетические конструкции работают в ткани-мишени от одной до нескольких недель и обеспечивают менее резкое и более длительное повышение содержания ангиогенного фактора, что позволяет избежать частых и многократных инъекций или инфузий. Однако генная терапия имеет и свои недостатки, связанные с введением чужеродного генетического материала и возможностью иммунного ответа при использовании для доставки генов аденовирусных векторов. В многочисленных экспериментальных работах, включая наши исследования [12–14, 19, 20], на моделях ишемии задних конечностей, хронической ишемии миокарда и ИМ как у мелких (мышь, крыса), так и у крупных (кролик, собака, свинья, овца) животных были получены бесспорные доказательства стимуляции как ангио-, так и артериогенеза, а также улучшения функции и перфузии миокарда или скелетных мышц при использовании плазмидных и аденовирусных конструкций, содержащих кодирующую часть генов ФР. В большинстве этих работ тестировали конструкции с VEGF и FGF (секретируемый FGF-4), регулируемые цитомегаловирусным промотором.
   Первые неконтролируемые клинические исследования по генной терапии ИБС и КИНК дали два важнейших результата. Во-первых, были доказаны хорошая переносимость, возможность выполнения и кратковременная безопасность введения в миокард и скелетные мышцы генетических конструкций, кодирующих ангиогенные факторы как при использовании плазмидных, так и аденовирусных векторов. Во-вторых, удалось апробировать разные способы введения генетических конструкций в сердце: 1) внутримиокардиальное, осуществляемое во время АКШ или через малую торакотомию, 2) трансэндокардиальное – с помощью катетера, имеющего специальное устройство для инъекций и датчик, сопряженный с системой электромеханического картирования полости левого желудочка (ЛЖ), позволяющей детектировать зоны гибернирующего миокарда и вводить препарат непосредственно в эту зону, 3) а также внутрикоронарное. Показаны возможность проведения и хорошая переносимость этих процедур. Практически во всех работах были получены положительные предварительные результаты их эффективности.
   Однако двойные слепые плацебо-контролируемые исследования (фазы II/III) по генной терапии для стимуляции ангиогенеза дали смешанные результаты [13–16]. Так, в исследовании КАТ (введение в коронарную артерию VEGF-165 в плазмидном и аденовирусном векторе с помощью инфузионно-перфузионного катетера после ангиопластики и стентирования) существенное улучшение перфузии миокарда отмечено только при использовании гена VEGF в аденовирусном векторе. В другом исследовании EVROINJECT-1 (плазмиду с VEGF-165 вводили в зону гибернирующего миокарда трансэндокардиально с помощью катетера NOGA под контролем электромеханического картирования полости ЛЖ у 80 больных ИБС с III–IV классом стенокардии) через 3 мес не было обнаружено различий с группой плацебо по величине дефекта перфузии, однако локальная сократимость стенки ЛЖ у получивших генную терапию значительно улучшилась. Эффективность трансэндокардиального способа введения генетических конструкций тестировали еще в двух работах – GENASIS и NOVA [14], которые были остановлены из-за осложнений, связанных с внутримиокардиальными инъекциями. Хотя трансэндокардиальный способ является наиболее привлекательным с точки зрения возможности точно локализованного и повторного введения, он сопряжен с высоким риском возникновения осложнений и требует специально обученного высокопрофессионального персонала.
   В рандомизированном исследовании REVASC при внутримиокардиальном введении через малую торакотомию VEGF-121 в аденовирусном векторе повышалась толерантность к нагрузке и уменьшался класс стенокардии у 67 неоперабельных больных ИБС [13, 14]. Эти данные, с одной стороны, позволяют надеяться на то, что можно улучшить результаты лечения и прогноз у тяжело больных ИБС, которым невозможно провести реваскуляризацию, с другой стороны, к ним необходимо относиться осторожно, так как дизайн этого исследования исключал обследование адекватной контрольной группы больных. К тому же нельзя исключить, что торакотомия может стимулировать васкуляризацию миокарда.
   Эффективность внутрикоронарного введения генетического материала – аденовирусной конструкции с геном FGF-4 – тестировали в серии контролируемых клинических исследований AGENT-1, 2, 3 и 4 [14, 15]. Хотя в первых работах (AGENT-1 – 79 больных, AGENT-2 – 85 неоперабельных больных ИБС) при использовании большой дозы аденовирусной конструкции отмечено увеличение ТФН и уменьшение дефектов перфузии, в следующем межнациональном многоцентровом исследовании AGENT-4 (116 больных) различий с контрольной группой по увеличению ТФН не обнаружено, а аналогичное исследование AGENT-3 (416 больных) было остановлено из-за большого разброса значений ТФН в группах, что не позволяют получить достоверные различия. Однако при последующем анализе данных, полученных в разных подгруппах больных, было установлено, что генная терапия достоверно увеличивала ТФН в сравнении с контролем у пациентов старше 55 лет и с более тяжелой формой стенокардии (IV ФК).
   Из трех завершенных рандомизированных двойных слепых клинических испытаний по генной терапии у неоперабельных больных с КИНК [13, 14] в одном (VEGF-165 вводили в плазмидном или аденовирусном векторе в бедренную артерию) получили положительный результат (увеличение числа коллатеральных сосудов), во втором (плазмидную ДНК VEGF-165 вводили внутримышечно) – смешанный (число ампутаций за 100 дней без изменений, но имело место улучшение по лодыжечно-плечевому индексу, заживлению трофических язв и уменьшению болей в покое), и в третьем (исследование RAVE: VEGF121 в аденовирусном векторе вводили внутримышечно в пораженную конечность) – отрицательный по всем конечным точкам. Введение VEGF не приводило к каким-либо серьезным осложнениям за исключением преходящих отеков, которые являлись следствием воздействия VEGF на проницаемость сосудов.
   Почему же результаты контролируемых клинических исследований не оправдали ожиданий, которые были порождены данными экспериментальных и неконтролируемых клинических работ по терапевтическому ангиогенезу? Одна из причин – несоответствие многих экспериментальных моделей ишемии тканей и особенностей реваскуляризации миокарда и скелетных мышц у человека и животных, особенно у мелких животных, на которых выполняли большинство работ. Другой причиной может быть введение значительно меньших доз генно-терапевтических препаратов людям из-за опасения возможных осложнений. Так, крысам плазмиду с VEGF-165 вводили в дозах 125–500 мкг на животное массой 250–300 г, людям – в дозах 500–2000 мкг на человека, массой в среднем 75 кг. Осторожность в применении больших доз VEGF в клинических исследованиях связана с опасением возможной стимуляции латентных опухолей или развития ангиом, хотя ни в одном из завершенных контролируемых исследований подобных осложнений не отмечено. Поэтому генетические конструкции, в которых ген VEGF регулируется тканеспецифическим промотором, ограничивающим экспрессию ФР только тканью-мишенью, или промотором, регулируемым гипоксией, включающим экспрессию VEGF только в ишемизированной ткани, могут решить эту проблему.
   Важным фактором, определяющим эффективную стимуляцию роста новых сосудов, является длительность повышения продукции ангиогенных факторов в ишемизированных тканях. По нашим данным [19, 20] и данным других исследователей [13, 14], длительность экспрессии трансгена (ФР) при использовании плазмидных или аденовирусных векторов при введении в ткани не превышает 2 нед. На модели трансгенных мышей, у которых экспрессия VEGF регулируется тетрациклином, показано, что для того, чтобы вновь образованные сосуды в зоне ишемии дошли до той точки своего развития (стабилизации), в которой они уже не регрессируют при снижении уровня VEGF, необходимо повышение концентрации VEGF в ткани в течение не менее чем 4 нед [21]. Такая длительная экспрессия не обеспечивается плазмидными или аденовирусными векторами, а во всех клинических исследованиях однократно вводили именно эти генетические конструкции. Решение данной проблемы может быть найдено при повторном введении плазмидных конструкций или при использовании векторов на основе аденоассоциированных вирусов, эффективно переносящих генетический материал в миокард и скелетные мышцы, обеспечивающих более длительную экспрессию трансгенов, непатогенных и низкоиммуногенных для человека [13, 14]. Активация эндотелиальной NO-синтазы является важной составляющей механизмов действия VEGF и FGF, поэтому недостаточная эффективность генной терапии может быть обусловлена наличием эндотелиальной дисфункции у больных атеросклерозом. Совместное использование генов VEGF и эндотелиальной NO-синтазы или простациклинсинтазы [22, 23], а также введение фермента (DDAH), подавляющего активность эндогенного ингибитора эндотелиальной NO-синтазы (ADMA), позволяют значительно усилить эффективность генной терапии VEGF у экспериментальных животных [24].
   Ангиогенез – сложный процесс, осуществляемый путем строго скоординированной во времени и пространстве работы многих факторов. Расширение арсенала ангиогенных факторов, используемых для терапевтического ангиогенеза, а также подбор оптимальных сочетаний и режимов их введения могут способствовать повышению эффективности лечебной тактики. В экспериментальных работах совместное использование VEGF и фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, а также тромбоцитарного ФР (PDGF-BB) в сочетании с FGF-2 индуцирует образование сосудистой сети, которая остается стабильной даже через 1 год после прекращения действия этих факторов [25, 26]. Еще одним подходом к более сбалансированной стимуляции ангиогенеза может быть создание генетических конструкций на основе гибрида геномной ДНК и кДНК форм гена VEGF, которые содержат экзоны и интроны в различно сплайсирующейся области, что обеспечивает экспрессию нескольких изоформ VEGF, как это естественно происходит в тканях [27]. Большие возможности генной терапии ИБС связывают с использованием ФР гепатоцитов (HGF), который эффективно стимулирует ангиогенез и обладает кардиопротективными свойствами, обусловленными его способностью активировать миграцию и мобилизацию резидентных СК сердца и подавлять развитие фиброза миокарда [28]. Другая стратегия может быть основана на использовании генов, кодирующих факторы, активирующие включение многих ангиогенных молекул. Например, введение генетической конструкции, конститутивно экспрессирующей HIF-1alpha, активирующий экспрессию ангиогенных факторов, эффективно стимулировало реваскуляризацию ишемизированной конечности кролика и тестируется в исследовании WALK [14–16] у больных с КИНК.
   Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что фактором, обеспечивающим более генерализованные сигналы к запуску ангиогенеза, может быть активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа) – сериновая протеаза, ключевой регулятор внеклеточного протеолиза и ремоделирования тканей [29]. У мышей, нокаутированных по гену урокиназы, подавлен артериогенез в ишемизированной конечности и ангиогенез в сердце, а VEGF не способен стимулировать ангиогенез в периинфарктной зоне, в то время как у диких мышей он оказывает выраженный ангиогенный эффект [30]. Эти данные подтверждают, что урокиназа опосредует ангиогенные эффекты факторов роста. Мы изучали эффекты внутримиокардиального и внутримышечного введения плазмидной конструкции с комплиментарной ДНК (кДНК) урокиназы (человека, крысы и мыши) на моделях ишемии задней конечности у мыши и крысы и ИМ у крысы [19, 20]. Было показано, что урокиназа стимулирует развитие капилляров и артериол и увеличивает аккумуляцию макрофагов в периинфарктной зоне, уменьшает размер формирующегося ИМ, увеличивает васкуляризацию, ускоряет восстановление перфузии и предотвращает развитие некроза в ишемизированной конечности (рис. 1, а–г). Эффективность плазмидной конструкции с геном урокиназы была близка к эффективности подобной конструкции, содержащей ген VEGF, при этом урокиназа не вызывала отек конечности. Следует особо подчеркнуть, что ни в одном из случаев введения плазмид при ИМ и ишемии конечности не было отмечено формирования ангиом. Полученные результаты свидетельствовали о том, что генная терапия путем прямых внутримиокардиальных/внутримышечных инъекций раствора плазмиды с кДНК урокиназы может эффективно стимулировать ангио- и артериогенез и улучшать перфузию ишемизированных тканей. Мы предполагаем, что преходящее увеличение содержания урокиназы в ишемизированных тканях может привести к стимуляции ангио- и артериогенеза благодаря активации латентных и высвобождению связанных в матриксе ангиогенных ФР; активации матриксных металлопротеаз, стимуляции миграции и пролиферации ЭК и ГМК сосудов; потенцированию действия ангиогенных факторов; привлечению моноцитов в участок ишемии и последующей секреции ими ангиогенных факторов и цитокинов; предотвращению тромбоза сосудов, который служит дополнительным фактором, усугубляющим ишемию тканей при нарушениях магистрального кровотока. Использование комбинированной генной терапии VEGF с урокиназой позволяет в 2 раза снизить дозу плазмиды VEGF без потери эффективности и уменьшить побочное действие терапии VEGF, проявляющееся в развитии отеков. На основе плазмидных генетических конструкций с кДНК урокиназы и VEGF-165 созданы лекарственные препараты для генной терапии, которые прошли токсикологические исследования и планируются для клинических испытаний у больных с КИНК.

Стимуляция неоваскуляризации с помощью клеточной терапии
   
В последние годы новые надежды в области терапевтического ангиогенеза связаны с разработкой технологии клеточной терапии. Стимуляция ангиогенеза наряду с восстановлением поврежденного миокарда и его функции – основные цели клеточной терапии ИБС и ее осложнений. Эффективный миогенез в миокарде и скелетных мышцах невозможен без ангиогенеза, а ангиогенез – без миогенеза. Именно СК и прогениторные клетки потенциально способны стимулировать оба процесса [31]. Механизмы репаративного действия СК, полученных из взрослого организма, включают паракринные эффекты, связанные с их секреторной активностью, дифференцировку в специфические клетки ткани и сосудов и слияние с клетками ткани, что позволяет придать им новые свойства [15, 32]. Удельный вес каждого из этих механизмов до конца не определен и экспериментальные данные довольно противоречивы. Не углубляясь в вопросы, связанные с дифференцировкой в КМЦ, отметим, что участие СК в построении новых сосудов путем дифференцировки в ЭК продемонстрировано в нескольких экспериментальных работах с помощью трансплантации меченых клеток костного мозга [9–11]. Однако в значительной степени стимуляция неоваскуляризации при введении СК осуществляется за счет их секреторной активности. Это подтверждается тем фактом, что увеличение количества сосудов в миокарде экспериментальных животных отмечалось при введении практически всех типов клеток, используемых для клеточной терапии: гематопоэтических и мезенхимальных клеток костного мозга, предшественников ЭК (циркулирующих и костно-мозговых), клеток, полученных из пуповинной крови и даже скелетных миобластов [15, 32–37]. Как и при использовании генной терапии или рекомбинантных ФР (РФР), результаты экспериментальных и первых клинических работ по клеточной терапии были очень оптимистичными и свидетельствовали о возможности улучшить неоваскуляризацию ишемизированного миокарда и скелетных мышц, о безопасности и хорошей переносимости клеточной терапии. Однако при оценке ее эффективности в первых двойных слепых плацебо-контролируемых исследованиях получены весьма неоднозначные данные [15, 32–34]. В иследованиях REPAIR-AMI, ASTEMI и BOOST изучали эффективность введения в предварительно стентированную ответственную за ИМ артерию аутологичных клеток костного мозга (мононуклеарной фракции или фракции, обогащенной ПЭК, – CD133+-клетками) или мононуклеарных клеток периферической крови для предотвращения неблагоприятного ремоделирования ЛЖ у больных с ИМ с подъемом сегмента ST. В исследовании REPAIR-AMI были получены положительные результаты, а в аналогичном по дизайну исследовании ASTEMI – отрицательные. В исследовании BOOST увеличение фракции выброса (ФВ) через 6 мес было достоверно большим в группе получавших клеточную терапию, но через 18 мес это различие исчезло за счет увеличения ФВ в контрольной группе, однако скорость восстановления ФВ на протяжении всего периода наблюдения оставалась более высокой у пациентов, получавших клеточную терапию. Внутрикоронарное введение мононуклеарной фракции костного мозга больным с постинфарктной сердечной недостаточностью (TOPCARE-CHD) позволило в течение 1,5-летнего наблюдения улучшить функцию ЛЖ, снизить уровни мозгового и предсердного натрийуретических пептидов в крови, а также смертность [32, 33]. Неоднородные результаты были получены и при мобилизации клеток костного мозга с помощью цитокинов. Так, в исследованиях STEMMI и REVIVAL-2 [32, 35] мобилизация клеток с помощью гранулоцитоколониестимулирующего фактора (G-CSF) у больных с ИМ и успешной эндоваскулярной реваскуляризацией не приводила к более выраженному увеличению глобальной или локальной сократимости ЛЖ, а в исследовании FIRSTLINE-AMI с аналогичным дизайном сопровождалась более выраженным увеличением региональной и общей сократительной функции, диастолической толщины стенки в области инфаркта и предотвращала неблагоприятное ремоделирование ЛЖ.
   В последние годы особый интерес в плане терапевтического ангиогенеза вызывают ПЭК, которые могут быть выделены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Показано, что in vitro они могут дифференцироваться в ЭК и КМЦ, а при введении в зону инфаркта у экспериментальных животных стимулируют неоваскуляризацию и инкорпорируются в сосуды [9–11]. Однако в клинических работах наряду с положительным влиянием на функциональное состояние и перфузию миокарда была отмечена высокая частота рестенозов и нарастания тяжести атеросклероза при введении фракции клеток костного мозга, обогащенной ПЭК (CD133+-клетками), в стентированную ответственную за ИМ артерию [36]. Учитывая, что ПЭК могут участвовать в репарации поврежденного эндотелия и в ангиоваскулогенезе, эти эффекты могут быть обусловлены избыточной репаративной реакцией и стимуляцией неоваскуляризации стенки поврежденного сосуда при введении в него ПЭК. В то же время внутримиокардиальное введение ПЭК во время АКШ в рандомизированном исследовании не вызывало подобных осложнений и приводило к более выраженному увеличению ФВ в группе клеточной терапии, особенно у больных с низкими ее величинами (<35%) [37].
   В настоящее время вопрос о том, что эффективнее может стимулировать ангиогенез – селективно-изолированная популяция ПЭК или смешанная популяция мононуклеарных или мезенхимальных клеток костного мозга, не имеет ответа. Учитывая, что сосуд формируется несколькими типами клеток, логично предположить, что смешанная популяция, содержащая предшественники ЭК и ГМК, может оказаться более эффективной. Однако это предположение нуждается в подтверждении.
   Поскольку не во всех контролируемых исследованиях по клеточной терапии оценивали перфузию миокарда, говорить о вкладе стимуляции ангиогенеза в улучшение функции сердца затруднительно. Однако результаты экспериментальных работ, которые явились основой для проведения этих клинических испытаний, позволяют утверждать, что стимуляция неоваскуляризации при введении клеток является одним из основных механизмов их терапевтического эффекта. Одной из причин недостаточной эффективности клеточной терапии может быть как раз снижение ангиогенной активности аутологичных прогениторных клеток у больных ИБС, особенно пожилого возраста. В наших исследованиях, проведенных совместно с отделением хронической ИБС и ангиологии, было показано, что общее содержание CD34+-клеток в периферической крови больных ИБС снижено вдвое по сравнению с таковым у людьми того же возраста, но без ИБСРабота аспирантов О.Н.Выборова и М.М.Руда.. В других работах показано снижение ангиогенных свойств клеток костного мозга (способности формировать колонии, мигрировать в ответ на VEGF и SDF-1 и реваскуляризировать ишемизированную конечность иммунодефицитных мышей) у больных ИБС [38].

Рис. 1. Влияние прямого введения плазмид с генами урокиназы и VEGF на ангиоартериогенез в сердце крысы и ишемизированной конечности мыши.
а – количество капилляров и артериол в периинфарктной зоне на 14-й день после ИМ и введения плазмид (*p<0,05). б – размер формирующегося постинфарктного рубца на 14-е сут после перевязки ПНА и инъекции плазмид. Данные представлены в виде отношения площади рубца к площади ЛЖ на поперечных срезах сердца. Вверху – окраска срезов сердца по Маллори: богатая коллагеном область рубца окрашивается в синий цвет, а жизнеспособный миокард ЛЖ – в красный. в – восстановление перфузии подошвенной области ишемизированной левой конечности мыши (лазерное допплеровское сканирование, пример внизу) после введения плазмид. За 100% принят кровоток в неишемизированной правой конечности; г – оценка развития отека по изменению соотношения массы мышцы к массе тела мыши.
*p<0,05; **p<0,01.



Рис. 2. Ангиогенные свойства стромальных клеток ЖТ.
а – увеличение экспрессии мРНК проангиогенных факторов СКЖТ в условиях гипоксии; б – влияние гипоксии на секрецию ангиогенных факторов (VEGF и HGF) стромальными клетками ЖТ; в – развитие капилляроподобых структур на поверхности матригеля ЭК аорты и стромальными клетками ЖТ человека; г – восстановление кровотока (перфузии) в ишемизированных конечностях иммунодефицитных мышей после введения СКЖТ человека (слева) и плотность капилляризации (CD31-позитивные клетки) в m. tibialis anterior мышей, которым вводили контрольную среду (ишемия) и СКЖТ (ишемия+СКЖТ). Контроль – без ишемии.
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.




Рис. 3. Влияние трансплантации СКЖТ на функцию сердца крысы после ИМ.
а – DiI-меченные СКЖТ крысы визуализируются в периинфарктной зоне через 1 нед после введения (ув. 200); б – динамика ФВЛЖ сердец крыс (в % от исходных значений ФВ неповрежденного сердца крысы) в течение 2 мес после ИМ и внутримиокардиального введения физиологического раствора (1), летально облученных СКЖТ (2), свежевыделенных СКЖТ (3) и культивированных СКЖТ (4).
*p<0,05; **p<0,01.




Рис. 4. Стимуляция ангиогенеза in vitro при сокультивировании популяции клеток, выделяемых из постнатальных сердец крыс, со стромальными клетками ЖТ.
а – количество капилляроподобных структур, спонтанно формируемых СКЖТ, смешанной популяцией клеток, выделенных из сердец новорожденных крысят (КС), при сокультивировании СКЖТ и КС (КС+СКЖТ) и при добавлении к КС кондиционированной среды, собранной с СКЖТ (КС+конд. ср);
б – капилляроподобные структуры (КПС), образованные при сокультивировании клеток постнатальных сердец со СКЖТ. CD31-позитивные (зеленая флюоресценция) КПС происходят преимущественно из клеток сердца, CM-DiI-Cell Tracker-меченные СКЖТ (красная флюоресценция) не входят в состав КПС, а локализуются вдоль них. В отдельных случаях КПС демонстрируют смешанное происхождение, что, видимо, обусловлено плотным контактом CD31-позитивных клеток сердца с СКЖТ.
*p<0,01.





Рис. 5. Дифференцировка с-kit-позитивных клеток, выделенных из мышечной части аневризмы сердца человека.
а – признаки кардиомиоцитарной дифференцировки (положительное окрашивание на Nkx2,5 и тропонин-I); б – признаки дифференцировки в клетки сосудов (положительное окрашивание на CD105 и СD31). Ядра окрашены DAPI в голубой цвет.



   Учитывая весьма существенный вклад паракринных эффектов в неоваскуляризацию, возможно, что именно секреторная активность клеток, а не их дифференцировочные свойства, определяет ангиогенную и тканепротективную эффективность. Если это так, то усиление паракринных эффектов трансплантируемых клеток путем их генетической трансформации с помощью конструкций, содержащих гены ФР, может быть перспективным подходом к повышению эффективности клеточной терапии.
   Использование генетически модифицированных СК и прогениторных клеток – сочетание генной и клеточной терапии – позволяет усилить положительные стороны каждого метода и нейтрализовать отрицательные. Введение в клетки генов ангиогенных и антиапоптотических факторов позволяет уменьшить гибель клеток после трансплантации, а также количество вводимых клеток, необходимое для достижения эффекта. Возможность in vitro помещать в клетки генетические конструкции, отбирать и вводить определенное количество модифицированных клеток позволяет преодолеть проблему низкой эффективности трансфекции при прямой генной терапии и проблему иммунного ответа при использовании аденовирусных векторов. Кроме того, появляется возможность относительно точно дозировать терапевтический эффект за счет определенного количества вводимых клеток.
   Скелетные миобласты, трансдуцированные с помощью ретро- или аденовируса геном VEGF-165, более эффективно стимулировали ангиогенез и миогенез и улучшали сократительную функцию ЛЖ на моделях постинфарктной сердечной недостаточности, чем немодифицированные клетки [39], а использование модифицированных предшественников ЭК, гиперпродуцирующих VEGF, позволило в 30 раз сократить количество клеток, необходимое для достижения желаемого эффекта [40]. Наиболее впечатляющие результаты получены при введении в сердце мыши модифицированных ретровирусной конструкцией мезенхимальных клеток костного мозга, конститутивно экспрессирующих Akt-киназу – внутриклеточную сигнальную молекулу, опосредующую пролиферативные и антиапоптотические сигналы. Модифицированные клетки значительно лучше восстанавливали функцию сердца после инфаркта, чем немодифицированные [41]. Первоначально предполагали, что этот эффект обусловлен уменьшением апоптотической гибели введенных клеток; однако позднее было показано, что экспрессия Akt-киназы в несколько раз увеличивала экспрессию ФР клетками и, вероятнее всего, усиление паракринных влияний обусловило повышение терапевтической эффективности модифицированных клеток. Улучшить выживание клеток после введения в поврежденную и ишемизированную ткань и терапевтический эффект клеточной терапии позволяет предшествующая терапия ФР, стимулирующая ангиогенез [42].
   В последние годы популяции мультипотентных клеток были выделены и из других соматических тканей. Особое внимание привлекает жировая ткань (ЖТ), доступная в большом количестве. Разные исследовательские группы продемонстрировали, что часть клеток, относящихся к стромальной, а не к адипоцитарной фракции ЖТ, при культивировании в специально подобранных условиях способна дифференцироваться в адипоциты, хондроциты, клетки костной и нервной тканей, ЭК и ряд других типов клеток [43]. Наши исследования были сосредоточены на оценке ангиогенных свойств и возможности стимулировать неваскуляризацию с помощью этих клеток Работа выполнена в рамках гранта CRDF в сотрудничестве с Центром сосудистой биологии и медицины (дир. – проф. К.Марч) Университета Индианы (США) нашими сотрудниками Д.О.Трактуевым и З.И.Цоколаевой. [20, 44]. Показано, что стромальные клетки ЖТ (СКЖТ), выделенные из продуктов липосакции человека или образцов ЖТ, полученных хирургическим путем, представляют собой гетерогенную популяцию клеток, содержащих более 25% CD34+-клеток. По мере культивирования клеток стромально-васкулярной фракции ЖТ количество CD34+-клеток, ЭК и лейкоцитов постепенно уменьшается вплоть до полного исчезновения к 4-му пассажу и происходит обогащение популяции клетками, несущими маркеры мезенхимальных клеток костного мозга, до 98%. СКЖТ экспрессируют и секретируют широкий набор ангиогенных, кардиопротективных и антиапоптотических факторов, таких как VEGF, HGF, bFGF, TGF, GM-CSF и ангиопоэтин-2, причем в условиях гипоксии экспрессия и секреция этих факторов увеличивается в несколько раз (рис. 2, а, б). Среда культивирования СКЖТ значительно улучшает выживание микрососудистых ЭК человека, культивируемых в обедненной ростовыми факторами среде, а сами СКЖТ, как и ЭК, способны формировать капилляроподобные структуры на поверхности матригеля (рис. 2, в). Имплантация под кожу мышам с иммунодефицитом матригеля, в который помещены СКЖТ человека, приводила к значительной стимуляции прорастания в него сосудов мыши, обусловленной паракринными эффектами СКЖТ, причем эта стимуляция была даже более выражена, чем эффект такого сильного стимулятора ангиогенеза, как bFGF. Введение СКЖТ человека в хвостовую вену или в мышцы конечности тимусдефицитных мышей линии NOD/SCID на следующий день после иссечения бедренной артерии предотвращало развитие некроза дистальных отделов лапы, стимулировало капилляризацию ишемизированных мышц, ускоряло восстановление кровотока в конечности (рис. 2, г).
   На модели ишемии/реперфузии миокарда у крыс-самцов линии Lewis (модель, приближенная к клинической ситуации) внутримиокардиальное введение СКЖТ, полученных от крыс-самок той же линии, улучшало функцию ЛЖ и стимулировало ангиогенез в сердце через 1 мес после ИМ, однако через 2 мес этот эффект уменьшался (рис. 3) [45]. Доминирующая роль паракринных механизмов в кардиопротективном эффекте СКЖТ подтверждается тем, что именно культивированные клетки, показавшие наилучший эффект, секретируют значительно больше VEGF, чем свежевыделенные. По-видимому, при введении в ишемизированную ткань СКЖТ за счет высокой секреторной активности обеспечивают благоприятную среду для окружающих клеток, стимулирующую их выживание, активирующую пролиферацию сателлитных СК органа, подавляющую апоптоз клеток и усиливающую ангиогенез.
   При исследовании эффектов сокультивирования СКЖТ крысы с клетками, выделенными из сердца новорожденных крысят Работа К.А.Рубиной, В.Ю.Сысоевой и З.И.Цоколаевой. [46], было обнаружено, что СКЖТ способствуют образованию большего количества более сложных (более ветвящихся) и стабильных сосудистых структур клетками постнатального сердца. Причем этот эффект обусловлен не только паракринными влияниями СКЖТ, а, возможно, и межклеточными взаимодействиями, так как при добавлении среды культивирования СКЖТ к клеткам, выделенным из сердца, наблюдался менее выраженный эффект (рис. 4, а). Сосудистые структуры, образованные эндотелиальными (СD-31+) клетками сердца, были окружены СКЖТ, экспрессирующими маркер перицитов NG2 (рис. 4, б). Наличие клеток, несущих маркеры перицитов, в популяции СКЖТ было продемонстрировано и с помощью проточной цитофлюорометрии. Возможно, что, помимо паракринных механизмов стимуляции неоваскуляризации, при введении СКЖТ они могут непосредственно участвовать в формировании сосудов и их стабилизации за счет перицитарных клеток, имеющихся в их составе.
   Кроме того, нам удалось показать, что СКЖТ хорошо поддаются трансдукции аденовирусными, лентивирусными, ретровирусными и аденоассоциированными вирусными векторами. Генетически модифицированные клетки, в которых гиперэкспрессирован ген VEGF, секретируют в 10 раз больше этого фактора, чем немодифицированные клетки. Таким образом, СКЖТ представляют собой популяцию клеток, обладающих высокой степенью пластичности, высокой интенсивностью пролиферации, высоким ангиогенным потенциалом, обусловленным в значительной степени их способностью секретировать многие проангиогенные и антиапоптотические факторы, и могут быть эффективным клеточным вектором для переноса терапевтических генов. При достаточно высоком содержании данного типа клеток в ЖТ, относительной безопасности и низкой травматичности их получения СКЖТ являются перспективными кандидатами для терапевтического ангиогенеза.
   Еще одним альтернативным источником аутологичных клеток для стимуляции неоваскуляризации миокарда могут быть резидентные СК сердца, существование которых и их репаративные свойства были показаны в работах группы П.Анверза [47]. Эти примитивные клетки характеризуются экспрессией антигена СК с-kit и рецептора к ФР-гепатоцитов, который является хемоаттрактантом для этих клеток. Показано, что в периинфарктной зоне количество этих клеток увеличивается, они пролиферируют и дифференцируются в КМЦ, ЭК и ГМК сосудов. Выделенные из образцов эндомиокардиальной биопсии эти клетки хорошо пролиферируют и при введении в область постинфарктного рубца способны улучшать функцию сердца и увеличивать количество жизнеспособного миокарда у иммунодефицитных крыс с моделью постинфарктной сердечной недостаточности [48]. Возможность использования резидентных СК сердца для его регенерации и реваскуляризации является очень привлекательной, однако существенная проблема, ограничивающая перспективу их клинического применения, заключается в сложности их получения: для этого требуется биопсия миокарда. Нами исследована возможность выделения с-kit позитивных клеток из ткани аневризмы сердца, иссеченной в ходе хирургического вмешательства. Работа проведена совместно с отделом сердечно-сосудистой хирургии РКНПК и факультетом фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова [49]. В мышечной части аневризмы при иммуногистохимическом окрашивании обнаружены с-kit-позитивные клетки, располагающиеся кластерами между мышечными волокнами. Для получения из мышечной части аневризмы популяции клеток, обогащенных с-kit-позитивными клетками, мы использовали метод иммуномагнитной селекции. Последующее культивирование обогащенной популяции в дифференцировочных средах показало, что выделенные из аневризмы с-kit-позитивные клетки способны дифференцироваться в эндотелиальном, кардиомиоцитарном и нейрональном направлениях (рис. 5). Результаты этого пилотного исследования показывают, что из ткани аневризмы сердца, удаляемой при ее хирургическом иссечении, можно выделить с-kit-позитивные клетки, вероятно, являющиеся резидентными СК сердца. Если это предположение подтвердится, то ткань аневризмы может стать источником аутологичных СК сердца для их изучения и, возможно, для клеточной терапии этой категории больных.

   

Исследования авторов статьи выполнены при поддержке РФФИ (грант №06-04-081138-ОФИ) и CRDF (гранты №RB1-2454-MO-02 и RUB1-2869-MO-07).

Литература
1. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: 1182–6.
2. Svet-Moldavsky GJ, Chimishkyan KL. Tumor angiogenesis factor for revascularization in ischemia and myocardial infarction. Lancet 1977; 1: 913–6.
3. Isner JM, Pieszek A, Schainfeld R et al. Clinical evidence of angiogenesis following gene transfer of phVEGF165. Lancet 1996; 348: 370–4.
4. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 2000; 6 (4): 389–95.
5. Wustmann K, Zbinden S, Windecker S et al. Is there functional collateral flow during vascular occlusion in angiographically normal coronary arteries? Circulation 2003; 107: 2213–20.
6. Schultz A, Lavie L, Hochberg I et al. Interindividual heterogeneity in the hypoxic regulation of VEGF: Significance for the development of the coronary artery collateral circulation. Circulation 1999; 100: 547–52.
7. van Royen N, Voskuil M, Hoefer I et al. CD44 regulates arteriogenesis in mice and is differentially expressed in patients with poor and good collateralization. Circulation 2004; 109: 1647–52.
8. Panchal V, Rehman J, Nguyen A et al. Reduced pericardial levels of endostatin correlate with collateral development in patients with ischemic heart disease. J Am Coll Cardiol 2004; 43: 1383–7.
9. Urbich C, Dimmler S. Endotelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ Res 2004; 95: 343–53.
10. Smadja DM, Cornet A, Emmerich J et al. Endothelial progenitor cells: characterization, in vitro expansion, and prospects for autologous cell therapy. Cell Biol Toxicol. 2007; 23 (4): 223–39.
11. Dong C, Goldschmidt-Clermont PJ. Endothelial progenitor cells: a promising therapeutic alternative for cardiovascular disease.
J Interv Cardiol 2007; 20 (2): 93–9.
12. Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Вопр
. мед. хим. 2000; 46: 293–310.
13. Yla-Herttuala S, Rissanen TT, Vajanto I. Vascular endothelial growth factors: biology and current status of clinical application in cardiovascular medicine. JMCC 2007; 49: 1015–26.
14. Rissanen TT, Yla-Herttuala S. Current status of cardiovascular gene therapy. Mol Ther 2007; 15: 1233–47.
15. Tirziu D, Simons M. Angiogenesis in the human heart: Gene and cell therapy. Angiogenesis 2005; 8: 241–51.
16. Springer MA. Balansing act: Therapeutic approaches for the modulation of angiogenesis.Curr Opin Invest Drugs 2006; 7: 243–50.
17. Selke F, Laham R, Edelman E et al. Therapeutic angiogenesis with basic fibroblast growth factor: Technique and early results. Ann Thorac Surg 1998; 65: 1540–4.
18. Kornowski R, Fuchs S, Leon MB, Epstein SE. Delivery strategies to achieve therapeutic myocardial angiogenesis. Circulation 2000; 101: 454–8.
19. Tractuev D, Tsokolaeva Z, Shevelev A et al. Urokinase Gene Transfer Augments Angiogenesis In Ischemic Skeletal And Myocardial Muscle. Mol Ther 2007; 15 (in press).
20.
Парфенова Е.В., Цоколаева З.И., Трактуев Д.О. и др. Поиск новых "инструментов" для терапевтического ангиогенеза. Мол. мед. 2006; 2: 10–23.
21. Dor Y, Djonov V, Keshet E et al. Conditional switching of VEGF provides new insight into adult neovascularization and pro-angiogenic therapy. EMBO J 2002; 21: 1939–47.
22. Brevetti LS, Chang DS, Tang GL et al. Overexpression of endothelial nitric oxide synthase increases skeletal muscle blood flow and oxygenation in severe rat hind limb ischemia. J Vasc Surg 2003; 38: 820–6.
23. Hiraoka K, Koike H, Yamamoto S et al. Enhanced therapeutic angiogenesis by cotransfection of prostacyclin syntase gene or optimization of intramuscular injection of naked plasmid DNA. Circulation 2003; 108: 2689–96.
24. Jacobi J, Sydow K, von Degenfeld G et al. Overexpression of dimethylarginine dimethylaminohydrolase reduces tissue asymmetric dimethylarginine levels and enhances angiogenesis. Circulation 2005; 111: 1431–8.
25. Shyu K-G, Chang H, Isner JM. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hind limb ischemia. Life Sciences 2003; 73: 563–79.
26. Cao R, Brakenhielm E, Pawliuk R et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF. Nat Med 2003; 9: 604–13.
27. Whitlock PR, Hackett NR, Leopold PL et al. Adenovirus-mediated transfer of a minigene expressing multiple isoforms of VEGF is more effective at inducing angiogenesis than comparable vectors expressing individual VEGF cDNAs. Mol Ther 2004; 9: 67–75.
28. Azuma J, Taniyama Y, Takeya Y et al. Angiogenic and antifibrotic actions of hepatocyte growth factor improve cardiac dysfunction in porcine ischemic cardiomyopathy Gene Therapy 2006; 13: 1206–13.
29. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Ткачук В.А. Активаторы плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе. Биохимия. 2002; 6: 119–34.
30. Heymans S et al. Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure. Nat Med 1999; 5: 1135–42.
31. Tomita S, Mickle DA, Weisel RD et al. Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg 2002; 123: 1132–40.
32. Haider HKh. Bone marrow cells for cardiac regeneration and repair: current status and issues. Expert Rev Cardiovasc Ther 2006; 4: 557–68.
33. Jolicoeur EM, Granger CB, Fakunding JL et al. Bringing cardiovascular cell-based therapy to clinical application: perspectives based on a National Heart, Lung, and Blood Institute Cell Therapy Working Group meeting. Am Heart J 2007; 153: 732–42.
34. Cho HJ, Lee J, Wecker A, Yoon YS. Bone marrow-derived stem cell therapy in ischemic heart disease. Regen Med 2006; 1: 337–45.
35. Kastrup J, Ripa RS, Wang Y, Jorgensen E. Myocardial regeneration induced by granulocyte-colony-stimulating factor mobilization of stem cells in patients with acute or chronic ischaemic heart disease: a non-invasive alternative for clinical stem cell therapy? Eur Heart J 2006; 27: 2748–54.
36. Bartunek J, Vanderheyden M, Vanderkerckhove B et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction. Circulation 2005; 112 (suppl. I): I-178–I-183.
37. Stamm C, Kleine HD, Choi YH et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease: safety and efficacy studies. J Thorac Cardiovasc Surg 2007; 133: 717–25.
38. Heeschen C, Lehmann R, Honold J et al. Profoundly reduced neovascularisation capacity of bone marrow mononuclear cells derived from patients with chronic ischemic heart disease. Circulation 2004; 109: 1615–22.
39. von Degenfeld G, Banfi A, Springer ML, Blau HM. Myoblast-mediated gene transfer for therapeutic angiogenesis and arteriogenesis. Br J Pharmacol 2003; 140: 620–6.
40. Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C et al. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation 2002; 105: 732–8.
41. Noiseux N, Gnecchi M, Lopez-Ilasaca M et al. Mesenchymal stem cells overexpressing akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol Ther 2006; 14: 840–50.
42. Retuerto MA, Beckmann JT, Carbray J et al. Angiogenic pretreatment to enhance myocardial function after cellular cardiomyoplasty with skeletal myoblasts J Thorac Cardiovasc Surg 2007; 133: 478–84.
43. Zuk PA, Zhu M. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.
Mol Biol Cell 2002; 13: 4279–85.
44. Трактуев Д.О., Ткачук В.А., Марч К.Л., Парфенова Е.В. Стромальные клетки жировой ткани – мультипотентные клетки с терапевтическим потенциалом для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей. Кардиология
. 2006; 46: 53–63.
45. Brian J, Tsokolaeva Z, Tractuev D et al. Preservation of heart function following myocardial infarction using abundant source of autologous stem cells derived from adipose tissue. Circulation 2005; 112 [suppl. II]: II–149.
46. Rubina KA, Tsokolaeva ZI, Melikhova VS et al. Stromal Vascular Cells stabilize vessel-like structures in vitro through cell-cell contacts and secreted angiogenic factors. Proceedings of the Third International Meeting on Angiogenesis. March 1–3, 2007. Amsterdam, the Netherlands. p. 69.
47. Leri A, Kajstura J, Anversa P Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev 2005; 85: 1373–416.
48. Smith RR, Barile L, Cho HC et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation 2007; 115: 896–908.
49.
Рубина К.А., Цоколаева З.И., Рахмат-Заде Т.М. и др. Аневризма сердца – новый источник мультипотентных клеток-предшественников. Материалы ХХ съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова, Москва, 4–8 июня 2007. Изд. дом "Русский врач": 80.



В начало
/media/cardio/07_02/5.shtml :: Sunday, 18-Nov-2007 22:10:46 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster