Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

ГИНЕКОЛОГИЯ  
Том 08/N 3/2006 ЭНДОКРИНОЛОГИЧЕСКАЯ ГИНЕКОЛОГИЯ

Роль неслучайной инактивации Х-хромосомы в формировании преждевременной недостаточности функции яичников


Л.А.Марченко, Д.В.Залетаев, З.Г.Габибуллаева, Д.С.Михайленко

ГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Медико-генетический научный институт РАМН, НИИ Молекулярной медицины при ММА им. И.М.Сеченова, Москва

Преждевременная яичниковая недостаточность (ПНЯ) описывается как "многофакторный синдром", в развитии которого могут принимать участие генетические, иммунные, инфекционные, ятрогенные, психогенные и другие факторы [1]. Данная патология проявляется вторичной аменореей, низким уровнем эстрогенов, бесплодием на фоне повышенного уровня гонадотропинов (ФСГ, ЛГ). В структуре первичной аменореи ПНЯ составляет 10-28% [2]. У женщин с вторичной аменореей ПНЯ встречается с частотой 4-18% [3].
   Согласно точке зрения большинства исследователей, ПНЯ формируется в результате делеций как в коротком, так и в длинном плечах Х-хромосомы (Xq) или наличия моногенных заболеваний. Делеции длинного плеча Хq представлены множеством вариантов. Область Xq13 является наиболее важным районом для поддержания функционирования яичников. Возможно, в этом участке находится центр инактивации Хq, что подтверждается клинической картиной, характерной для гипергонадотропного гипогонадизма. Наиболее протяженные делеции захватывают область Xq13 и ассоциированы с первичной аменореей, отсутствием молочных желез и полным истощением яичников [4-8]. Для Xq не найдено каких-либо определенных точек разрыва, хотя в свете современных молекулярно-генетических открытий терминальные делеции можно расположить по значимости их влияния на функционирование яичников в таком порядке: Xq13-21, Xq22-25 и Xq26-28. В 1995 г. Ogata и Matsuo выявили сильную корреляционную зависимость между функционированием яичников и представленной выше последовательностью делеций в длинном плече Хq [8].
   Инактивация Хq (ИХХ) характерна для млекопитающих и заключается в том, что одна из двух родительских Хq (отцовская или материнская) случайным образом инактивируется для обеспечения одинакового количества функционирующих X-сцепленных генов у представителей обоих полов [9]. Однако в ряде случаев имеет место избирательная ИХХ одного из родителей. Существуют данные о том, что неслучайная ИХХ встречается в норме в экстраэмбриональных тканях [10], а также при некоторых патологических состояниях: у мозаиков 45Х/46ХХ [11], у женщин со структурными аберрациями Хq [12], у бессимптомных носителей синдрома Ретта (Х-сцепленное доминантное заболевание) [13] и при поликистозе и преждевременном истощении яичников [9, 14]. В целом частота неслучайной ИХХ в популяциях оценивается в 1,5-3,5% (Gale и соавт. 1997; Plenge и соавт. 1997; Lanasa и соавт. 1999) [15].
   Выявление неслучайной ИХХ осуществляется с помощью методов, основанных на определении дифференциального метилирования активной и неактивной Хq. Непосредственно анализируются полиморфизмы Х-сцепленных генов - полиморфизм сайта узнавания рестриктазы BstXl в первом интроне гена фосфоглицерокиназы [10] или полиморфизм CAG-повтора в первом экзоне гена андрогенового рецептора (AR) [10, 16]. В том числе можно использовать метилчувствительную или метилспецифическую ПЦР с целью определения неслучайной инактивации Хq у пациентов с ПНЯ.   

Материалы и методы
   
Обследованы 72 женщины с ПНЯ. Средний возраст пациенток составил 33,4±0,8 года, средняя продолжительность заболевания - 6,3±0,7 года, средний уровень ФСГ - 106,4±4,8 МЕ/л, ЛГ - 90,5±5,6 МЕ/л, Е2 - 76,7±9,7 МЕ/л, ТТГ - 2,7±0,38 мМЕ/л, ингибин В - 10,6±1,16 пг/л при двух определениях. У этих пациенток самостоятельная менструация отсутствовала 6 мес и более. Исследование проводили у женщин Европейской части России.
   Больным осуществляли полное клиническое обследование, включающее семейный анамнез, данные о менархе и регулярности предшествующих менструаций, акушерский анамнез. Всем обследованным проводили гинекологический осмотр, ультразвуковое исследование органов малого таза, определение уровней гормонов (ФСГ, ЛГ, ТТГ, Е2, ингибин В) и кариологическое исследование.   

Цитогенетический анализ
   
Хромосомные препараты готовили из культуры лимфоцитов периферической крови. Подсчитывали под микроскопом не менее 25 метафазных пластинок. Детальный анализ хромосом проводили на микрофотографиях с составлением кардиограммы. Дифференцированное окрашивание хромосом (G-метод) проводили по методу Seabright с предобработкой трипсином.   

Выделение ДНК и определение неслучайной инактивации Xq
   
Геномную ДНК выделяли по модифицированному методу фенол-хлороформной экстракции [17]. Затем геномную ДНК обрабатывали рестриктазой Hhal, которая только в том случае гидролизует цепи ДНК, если цитозин CpG-динуклеотида в ее сайтах узнавания не метилирован. Состав реакционной смеси: геномная ДНК - 1-2 мкг, буфер SEBufferY(lOx) ("СибЭнзим", Новосибирск) - 2 мкл, рестриктаза Hhal ("СибЭнзим", Новосибирск) - 10 ед., деионизированная вода - до 20 мкл. Реакционную смесь инкубировали при температуре 65°С в течение суток. Далее проводили ПЦР по описанному выше протоколу, как матрицу использовали 2 мкл смеси продуктов рестрикции.
   Длину CAG-повтора в гене AR определяли с помощью количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (КФ-ПЦР). Последовательности праймеров и условия амплификации описаны ранее [18]. Аналогом праймера CAGF2-HEX являлся праймер CAGF2-FAM (конъюгированный на 5-м конце с флуоресцентным красителем FAM). Фрагментный анализ осуществляли разделением ПЦР-продуктов на генетическом анализаторе ABI3100 согласно протоколам ABI Prism 3100 Genetic Analyzer Kits "Applied Biosystems". Идентификацию аллелей проводили с помощью программного обеспечения GeneMapper v. 3.5 "Applied Biosystems".
   Во всех информативных случаях определялась ИХХ. Считалось, что ИХХ имеет место при выполнении двух условий: отношение площади большего пика к сумме площадей двух пиков превышает 70% и при амплификации с рестриктов и нативной геномной ДНК это отношение отличается более чем на 3% [9, 14]. Кроме того, исследование проводилось в пороговых уровнях 80 и 90%.   

Таблица 1. Цитогенетический анализ

Кариотип

Больные с ПНЯ

46,ХХ

69 (95,8%)

46,XX/45,X/47,XXX

2 (2,8%)

46,Х

1 (1,4%)

Таблица 2. Частота неслучайной ИХХ

Пороговый уровень

Частота неслучайной ИХХ больные с ПНЯ

і90

3,3% (2/60)

і80

11,7% (7/60)

і70

25% (15/60)

Результаты
   
При изучении семейного анамнеза у 19 (26,4%) матерей наших пациенток отмечено несвоевременное выключение функции яичников: у 8 (11,1%) матерей преждевременная недостаточность яичников (до 40 лет), а у 11 (15,3%) - ранняя менопауза (до 45 лет). У матерей 8 (11,1%) пациенток были выявлены в анамнезе различные нарушения менструального ритма.
   Изучение преморбидного фона показало, что 45 (62,5%) больных имели высокий инфекционный индекс. Регулярные менструации установились с менархе у 60 (83,3%) женщин, средний возраст менархе составляет 13,2±1,4 года, олигоменорея отмечена у 12 (16,7%) больных. У 25 (34,7%) из 72 пациенток с ПНЯ в анамнезе были роды. У 19 (26,4%) пациенток - 1, у 6 (8,3%) - 2 родов. У 23 (31,9%) пациенток этой группы были аборты, у 4 (5,6%) - самопроизвольные выкидыши. В группе нерожавших пациенток аборты были только у 6 (8,3%) женщин. Таким образом, до начала заболевания фертильность была сохранена у 31 (43%) женщин с ПНЯ, т.е. практически у каждой 2-й пациентки.
   При клиническом обследовании 71 пациентки с ПНЯ выявлено: средний рост составил 161,5±3,8 см, средняя масса тела - 57,9±1,4 кг, индекс массы тела (ИМТ) - 24,7±3,6 кг/см2. Отмечено, что все женщины были правильного телосложения, с нормальным женским фенотипом, сохраненным интеллектом и у них отсутствовали какие-либо аномалии развития. Всем обследованным женщинам с ПНЯ было произведено исследование кариотипа. Среди 72 обследованных нами женщин аберрации Хq обнаружены у 3 (4,2%), из них 2 (2,8%) характеризовались низким уровнем мозаицизма и у 1 (1,4%) женщины - кариотип 45,Х. Данная пациентка фенотипически отличалась от описанных ранее больных низким ростом (150 см), диспластичными чертами - наличием деформированных ушных раковин, высоким арковидным небом, аномальным расположением зубов, короткой толстой шеей, низким ростом волос на затылке, широко расставленными сосками, наличием митрально-аортального порока сердца и аномальным развитием почек.
   Из 69 пациенток с нормальным кариотипом только 60 (87%) были гетерозиготы (информативны) по полиморфизму CAG-повтора гена андрогенного рецептора.
   Доля гомозигот по анализируемому локусу составила 9 (13%) женщин. Таким образом, количество информативных образцов ДНК составило 60 (87%).
   Для оценки неслучайной ИХХ мы использовали три пороговых уровня, классифицируемых, как і70, і80, і90%.
   Среди этих 60 женщин гетерозигот у 25% (15/60) была выявлена неслучайная инактивация Хq і70%, у 11,7% (7/60) і80%, у 3,3% (2/60) і90%. Результаты цитогенетического анализа представлены в табл. 1, а частота неслучайной ИХХ - в табл. 2.   

Обсуждение
   
В этом исследовании мы попытались разобраться, действительно ли неслучайная ИХХ имеет отношение к формированию ПНЯ.
   В задачу работы также входило изучение численных аномалий Хq у больных с ПНЯ. При исследовании кариотипа мы выявили 1 пациентку с наличием аномального клона 45,Х в кариотипе и 2 пациенток с низким уровнем мозаицизма по половым хромосомам 45,Х/46,ХХ (см. табл. 1). Подобные результаты описаны в литературе [19-21]. Подтверждением полученных нами данных являются ранее проведенные клинические наблюдения, согласно которым от 3 до 5% женщин с мозаичным 46,ХХ/45,Х кариотипом самостоятельно менструируют и в ряде случаев у них наступают самостоятельные беременности [22, 23]. Magee и соавт. описали пациентку с 45,Х-кариотипом, у которой было семь самостоятельно наступивших беременностей, однако скорее всего автор обследовал пациентку, имевшую ярко выраженный тканевый мозаицизм 46,ХХ/45,Х с преобладанием первого в яичниках, а второго в лимфоцитах периферической крови. Следует подчеркнуть, что у человеческого эмбриона 45,Х подобно всем млекопитающим с моносомией первично присутствуют герменогенные клетки, сохранение которых возможно в единичных экземплярах и является ключом к разгадке механизма фертильности при синдроме Тернера [24]. В ранее описанном случае больная с кариотипом 45,Х регулярно менструировала до 38 лет, однако подобно больным с дисгенезией гонад (синдром Тернера) она страдала митрально-аортальным пороком сердца и врожденной аномалией почек. Также обращало на себя внимание наличие у нее диспластичных черт, характерные для синдрома Тернера.
   Powell и соавт. высказали гипотезу о том, что ПНЯ может быть результатом нарушений в работе ограниченного числа генов, задействованных в развитии яичников [25, 26]. Широкий спектр аномалий Хq может вызвать патологию мейоза и в результате приводить к частичной гибели половых клеток [27]. Поэтому истощение запаса ооцитов у женщин может быть непосредственно связано с неспособностью обеспечить функционирование яичников в течение репродуктивного возраста.
   Однако мозаицизм 45,Х/46,ХХ в незначительном количестве клеток часто встречается в норме и увеличивается с возрастом [28-32]. Следовательно, наличие мозаицизма 45,Х/46,ХХ в незначительном проценте может и не является предрасполагающим фактором к ПНЯ.
   Установлено, что около 5% из 2000 генов, локализованных на Хq, избегают инактивации [33]. Гены кандидаты, участвующие в поддержании функции яичников, вероятно, находятся в этих эухроматиновых районах, однако до настоящего времени не проведены исследования, однозначно подтверждающие эту гипотезу.
   Исключив женщин с аберрациями Хq, мы определили Х-инактивационный статус. Для оценки неслучайной ИХХ мы использовали пороговый уровень і70%, і80%, і90%. Частота случаев инактивации Хq у обследованных нами женщин с ПНЯ составил і70-25%, і80 - 11,7%, і90 - 3,3%, в то время как в популяции, по данным Gale, Plenge, Lanasa, показатель ИХХ в пороговом уровне 70 и более составляет от 1,5-3,5%, что в 7,5 раз ниже полученных нами данных. При анализе результатов целесообразно отметить, что различные авторы предлагают отличающиеся друг от друга методы определения неслучайной инактивации Xq-хромосомы по CAG-повтору гена AR с детекцией меченых ПЦР-продуктов на генетических анализаторах. Например, в работе Sato и соавт. использовалась метилспецифическая ПЦР, а расчеты произведены для трех пороговых уровней: 70, 80 и 90% [9]; в работе Dijk и соавт. использовалась метилчувствительная ПЦР, рестриктаза Hpall, а пороговый уровень рассчитывался как изменение показателя ИХХ более чем на 30% при амплификации ДНК, обработанной Hpall, относительно нативной геномной ДНК [34]. В настоящей работе условия определения неслучайной инактивации по CAG-повтору AR также имели оригинальные модификации. Указанные различия в методах могут существенно влиять на частоту выявления неслучайной инактивации Хq. Это указывает на необходимость создания общепринятого протокола определения дифференциального метилирования Xq.
   Основываясь на данных об увеличении частоты неслучайной ИХХ с возрастом, мы проанализировали возраст 15 пациенток с ИХХ, который варьировал от 21 года до 43 лет. Таким образом, средний возраст пациенток составил 35,1±1,9 года, в связи с чем мы предположили, что как минимум один компонент неслучайной ИХХ не ассоциирован с возрастом, а связан с формированием ПНЯ.
   Как уже было сказано по поводу синдрома Тернера, некоторые гены, необходимые для функционирования яичников, могут быть необходимыми в 2 активных копиях и поэтому избегают ИХХ [35]. Предполагается, что незначительные структурные аберрации Хq могут приводить к ее неравновесной инактивации и далее к ПНЯ вследствие недостаточного функционирования генов, необходимые для развития яичников.
   Таким образом, одно из возможных объяснений состоит в том, что неслучайная ИХХ и связанные с ней ПНЯ являются результатом генетических нарушений, которые избирательно инактивируют и приводят к недостаточному функционированию генов, задействованных в формировании и развитии достаточного фолликулярного пула яичников.
   Поскольку случаи ярко выраженной неслучайной ИХХ были отмечены у женщин с ПНЯ, то мы предположили скрытые аномалии или мутации, которые не были идентифицированы при стандартном применении G-окраски, но эти нарушения могли привести к неслучайной ИХХ, клеточной селекции и затем к ПНЯ. Гены, вовлеченные в поддержание функционирования яичников, могут быть непосредственно повреждены при структурных аномалиях Хq и вызвать дисфункцию яичников. Генетические нарушения могут приводить к потере герменогенных клеток или снижению их количества относительно других клеточных субпопуляций, сопровождающихся неравновесной ИХХ и ПНЯ.
   Таким образом, генетические факторы могут играть важную роль в развитии ПНЯ. Для установления природы этих факторов необходимы дальнейшие исследования групп сцепления в семьях, что подтверждается особенностями семейного анамнеза у наших пациенток.   

Литература
1. Lamp T, Schultz-Lobmeyr I, Obruca A et al. Premature ovarian failure: etiology and prospects. Gynecol Endocrinol 2000; 14: 292-302.
2. Conway GS, Kaltsas G, Jacobs HS. Characterization of idiopatic c premature ovarian saibere. Fertil Steril 1996; 65: 337-41.
3. O`Herlity C, Pepperell RS, Evans SH. The significant of FSH Elevations in young women with disorders of onelction. Brit Med J 1980; 281: 1447-50.
4. Simpson JL. Genetic programming in ovarian development and oogenesis. In Menopause Biology and Pathobiology. eds. R.A.Lobo and J.M.R.Kelsey. 2000; 77-94. London: Academic Press.
5. Simpson JL., Raikovoc A. Ovarian differentiation and gonadal failure. Am J Med 1999; 89: 186-200.
6. Simpson JL. Genetics of female infertility. In: Proceedings of the Conference, Treatment of Infertility: The New frontiers, eds. M.Filicori and C.Flamigni. 1998; 37-52. Boca Raton, FL: Communications Media for Education, Inc.
7. James RS, Coppin D, Dalton P et al. A study of females with deletions of the short arm of the X chromosome. Hum Genet 1998; 102: 507-16.
8. Ogata T, Matsuo N. Turner syndrome and female sex chromosome aberrations: deduction of the principal factors involved in the development of clinical features. Hum Genet 1995; 95: 607-29.
9. Sato К, Uehara S, Hashiyada М et al. Genetic significance of skewed X-chromosome inactivation in premature ovarian failure. Am J Med Genetics 2004; 130 (3): 240-4.
10. Uehara S, Tamura M, Nate M et al. X-chromosome inactivation in the human trophoblast of early pregnancy. J Hum Genet 2000; 45: 119-26.
11. Uehara S, Sato K, Hashiyada M et al. Xchromosome inactivation patterns in 45,X/46,XX mosaics. J Hum Genet 2001; 46: 126-31.
12. Heard E, Clerc P, Avner P. X-chromosome inactivation in mammals. Ann RevGenet 1997; 31: 571-610.
13. Sirianni N, Pereira J, Pillotto R, Hoffinan EP. Rett syndrome: Confirmation of X-linked dominant inheritance, an localization of the gene to Xq28. Am J Hum Genet 1998; 63: 1552-8.
14. Hickey Т, Chandy A, Norman RJ. The androgen receptor CAG repeat polymorphism and X-chromosome inactivation in Australian Caucasian women withinfertility related to polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metabol 2002; 87 (1): 161-5.
15. Lanasa M, Hogge W, Hoffman E. The X chromosome and recurrent spontaneous abortions: The significance of transmanifesting carriers. Am J Hum Genet 1999; 64: 934-8.
16. Uehara S, Hashiyada M, Sato K et al. Preferential X-chromosome inactivation in women with idiopathic recurrent pregnancy loss. Fertil Steril 2001; 76: 908-14.
17. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
18. Chen C, Lamharzi N, Weiss NS et al. Androgen receptor polymorphisms and the incidence of prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11 (10): 1033-40.
19. Hodgson S, Chiu D, Polani P. Sexual development of patients with isochromosomes for the long arm of the X-chromosome. Hum Genet 1981; 58: 176-8.
20. Therman E, Susman B. The similarity of phenotypic effects caused by Xp and Xq deletions in the human female: a hypothesis. Hum Genet 1990; 85: 175-83.
21. Villaneuva AL, Rebar RW. Triple X syndrome and premature ovarian failure. Obstet Gynecol 1983; 62 (Suppl.): 705-35.
22. Abir R, Fisch D, Nitke S et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertile Steril 2001; 75: 141-6.
23. Hovatta O. Pregnancies in women with Turner's syndrome. Ann Med 1999; 31: 106-10.
24. Magee AC, Nevin NC, Armstrong MJ et al. Ullrich-Turner syndrome: Seven pregnancies in an apparent 45,X woman. Am J Med Genet 1998; 75: 1-3.
25. Marozzi A, Manfredini E, Tibiletti MG et al. Molecular definition of Xq common-deleted region in patients affected by premature ovatian failure. Hum Genet 2000; 107: 304-11.
26. Powell CM, Taggart RT, Drumhellen TC et al. Molecular and cytogenetic studies on an X; autosome translocation in a patient with premature ovarian failure and review of the literature. Am J Med Genet 1994; 52: 19-26.
27. Speed RM. Heterologous pairing and fertility in humans. In: Gilies CD, etiror. Fertility and chromosome pairing: Recent studies in plants and animals. Frorida: Boca Raton, CRC Press. 1989; p. 1-35.
28. Horsman DT, Dill FJ, McGilivray BC, Kalousek DK. X chromosome aneuploidy in lymphocyte cultures from women with recurrent spontaneous abortions. Am J Med Genet 1987; 61: 471-83.
29. Novinsky GP, Van Dyke DL, Tilley BC et al. The frequency of aneuploidy in cultured lymphocytes is correlated with age and gender but not with reproductive history. Am J Hum Genet 1990; 46: 11101.
30. Galloway SM, Buckton KE. Aneuploidy and aging: Chromosome studies on a random sample of the population using G-banding. Cetogenet Cell Genet 1978; 20: 78-95.
31. Jacobs PA, Court-Brown WM, Doll R. Distribution of human chromosome counts in relation to age. Nature 1961; 191: 1178-80.
32. Sandberge AA, Cohen MM, Rimm AA, Levin AA. Aneuploidy and age in population survey. Am J Hum Genet 1967; 19: 633-43.
33. Willard HF. The sex chromosomes and X chromosome inactivation. In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. eds. C.R.Scriver, A.L.Beaudet, W.S.Sly, D.Valle. 2001; 1: 1191-211. New York: McGraw-Hill.
34. Indsto JO, Nassif NT, Kefford RF, Mann GJ. Frequent loss of heterozygosity targeting the inactive X chromosome in melanoma. Clin Cancer Research 2003; 9: 6476-82.
35. Zinn AR, Ross JL. Turner syndrome and haploinsufficiency. Curr Opin Genet Dev 1998; 8: 322-7



В начало
/media/gynecology/06_03/40.shtml :: Saturday, 24-Feb-2007 16:58:46 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster