Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

ГИНЕКОЛОГИЯ  
Том 08/N 5/2006 ГЕНИТАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ

Качество лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем


Г.А.Дмитриев

ГУ ЦНИКВИ МЗ и СР РФ

Благодаря достижениям молекулярной биологии, электронной микроскопии, созданию высокотехнологичных методов детекции микроорганизмов наши представления об инфекциях, передаваемых половым путем (ИППП), которые еще недавно назывались венерическими заболеваниями, во многом изменились. Значительно возросло количество нозологий, частично или преимущественно связанных с половым путем передачи. Если 20-25 лет назад это в основном касалось сифилиса, гонореи и трихомониаза, то сейчас количество заболеваний, включенных в перечень ИППП, насчитывает более 10, причем процесс этот достаточно динамичный, и вряд ли сегодня можно с уверенностью назвать точную цифру списка. Так, например, согласно МКБ-10 бактериальный вагиноз, микоуреаплазмоз выведены из перечня ИППП, а папилломавирусная инфекция человека введена в него (пресс-релиз ВОЗ, 1996).
   Значительно увеличилось число сочетанных (смешанных) инфекций, причем как бактериальной (трепонемы, гонококки, хламидии), так и вирусной (герпес, папиллома, гепатиты, ВИЧ) этиологии, что во многом осложняет диагностику и терапию таких заболеваний. Возросло также количество скрытых, атипичных, хронических и малосимптомных форм ИППП. Например, доля скрытого сифилиса составляет более 40% среди ранних форм заболевания (Г.А.Дмитриев, Н.В.Фриго, 2004), а у 7-8 из 10 больных урогенитальным хламидиозом сроки заражения установить невозможно в связи с латентным течением.
   Данные о заболеваемости ИППП далеки от реальной картины, так как основываются главным образом на официальных источниках без учета коммерческих медицинских организаций, обследующих значительное число пациентов. Отсутствие нормативных научно обоснованных алгоритмов обследования и ведения пациентов также является одной из причин недостоверных результатов при оценке эпидемической ситуации в различных регионах и в стране в целом, что в свою очередь может способствовать принятию неадекватных организационных решений. В настоящее время в России нет единого центра (органа), объединяющего усилия многочисленных организаций - производителей тест-систем, диагностикумов, ингредиентов и потребителей - лабораторий и диагностических центров, осуществляющих постановку реакций, а также специалистов, разрабатывающих новые способы детекции возбудителей.
   Следует также отметить, что ежегодно в России количество лабораторных исследований, связанных с детекцией возбудителей ИППП и установлением диагноза, составляет несколько десятков миллионов анализов. Естественно, такой объем исследований требует значительных экономических, физических затрат и организационных мероприятий. Вместе с тем определенная часть лабораторных исследований не является научно обоснованной и может быть без какого-либо ущерба сокращена.
   В мировой практике накоплен огромный опыт, свидетельствующий о необходимости комплексности при клинико-лабораторном обследовании пациентов, так как использование разноплановых методологий (микроскопия, культура клеток, ПЦР-анализ, серологические исследования), которые дополняют и подтверждают друг друга, повышает достоверность диагноза и нивелирует технические ошибки (табл. 1). При различных формах и стадиях заболеваний реакция организма на внедрение патогенного возбудителя приводит к образованию разнообразных форм антительного ответа, которые возникают в разные сроки инфицирования и определяются с помощью различных методологий: ИФА, РПГА, микрореакции и т. д. Это особенно важно при невозможности проведения прямого метода идентификации возбудителя. Бледная трепонема - возбудитель сифилиса - не культивируется на питательных средах; существует целый ряд трудно культивируемых биологических объектов: хламидии, микоплазмы (M. genitalium), папилломавирус человека, вирус простого герпеса и т. д. Следует учитывать разнообразные локализации возбудителей ИППП (уретра, цервикальный канал, влагалище, прямая кишка), для которых показаны соответствующие методы детекции - ПИФ, ИФА, культура клеток, ПЦР-анализ и др. С другой стороны, существует опасность использования, и такие случаи нередки, ИФА и других серологических методологий без подтверждения прямыми методами идентификации при постановке диагноза хламидиоза, герпеса, трихомониаза и других, в том числе смешанных, ИППП. В таких ситуациях на первый план выходят методы детекции возбудителей, основанные на выявлении ДНК или РНК бактерий и вирусов, а также грибов и простейших, которые в Российской Федерации представлены исключительно методом ПЦР (приказ МЗ РФ №64). Однако в нашей стране до сих пор отсутствуют нормативные документы, регламентирующие применение этой методологии при лабораторной диагностике конкретных возбудителей. Наряду с неоспоримыми преимуществами амплификационных методов лабораторного анализа: высокая чувствительность, специфичность, воспроизводимость, неинвазивный способ получения материала (моча и др.), возможность исследования нескольких возбудителей в одной пробе, т.е. проведение скрининговых обследований и др., - существует ряд факторов, ограничивающих их использование в практике. Это невысокий технологический уровень производства тест-систем, низкий уровень автоматизации, требующий высокой квалификации и опыта персонала, регистрация продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза, что создает высокий риск контаминации и приводит к появлению ложноположительных результатов. Для нивелирования последнего феномена за рубежом и в меньшей степени в России применяются различные подходы, в том числе real-time PCR (ПЦР в режиме реального времени). Следует отметить, что в развитых зарубежных странах на протяжении многих лет проводится тщательное широкомасштабное сравнительное изучение тех или иных тест-систем, основанных на амплификационных технологиях, в результате чего установлены их высокая чувствительность и специфичность, имеется возможность (в случае получения дискордантных результатов) использования подтверждающих тестов на основе альтернативных амплификационных технологий. Недостаточное качество тест-систем (наборов), отсутствие утвержденных стандартов для всех этапов анализа (забор, транспортировка и хранение материала, пробоподготовка, интерпретация результатов), отсутствие регулярного контроля серий, выпускаемых независимыми экспертами головных НИИ, Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) и внутрилабораторного контроля значительно ограничивают использование этой, несомненно, перспективной и высокоэффективной технологии детекции возбудителей ИППП.
   Таким образом, основными недостатками диагностики ИППП являются следующие:
   • в арсенале лабораторий находится огромное количество методологий, с помощью которых осуществляется постановка диагноза;
   • осуществлять детекцию возбудителей всеми методами, как правило, в силу экономических, физических, организационных и других проблем не представляется возможным;
   • наблюдается субъективизм при использовании тех или иных методологий, а также инертность при переходе на новые технологии;
   • отсутствует посерийный контроль качества выпускаемых тест-систем (наборов), ингредиентов, а также контроль квалификации врачей-лаборантов, среднего и младшего медицинского персонала лабораторий;
   • в лабораториях совершенно недостаточно применяются контрольные (стандартные) материалы: охарактеризованные, лиофильно высушенные панели сывороток крови, препараты лиофилизированных культур микроорганизмов, микрофотограммы возбудителей, предоставляемых ФСВОК, с соответствующей документацией (табл. 2);
   • отсутствует регламент проведения исследований, а также информация о зарегистрированных тест-системах и их предназначении, а методические рекомендации и даже приказы МЗ РФ не имеют статуса обязательного выполнения.
   На основании изложенного следует, что выбор методов лабораторного анализа во многом зависит от квалификации, опыта клинициста и возможностей лаборатории. Безусловно, различные формы последипломного обучения, разнообразные методические рекомендации, пособия, монографии способствуют получению современных знаний и навыков в области лабораторных исследований. К положительным факторам следует отнести создание Протоколов ведения пациентов (ГУ ЦНИКВИ) - так называемых стандартов обследования и лечения больных сифилисом, гонореей и трихомониазом. Вместе с тем лабораторной диагностике в них уделено достаточно скромное место, представлен лишь перечень методов исследований без оценки их эффективности.
   Несмотря на многочисленные трудности, ошибки и недочеты, лабораторная диагностика наиболее распространенных и социально значимых ИППП достигла более высокого, современного уровня: созданы высокотехнологичные методологии, унифицировано производство питательных сред, ингредиентов для окраски мазков, оценка результатов осуществляется с помощью приборов в количественном варианте. Важным достижением современной диагностики, на наш взгляд, является возможность использования альтернативных методологий. Таким образом, за последние годы в лабораторной диагностике ИППП произошли заметные положительные изменения, позволившие в значительной мере оптимизировать клинико-лабораторное обследование пациентов, а также контролировать эффективность терапии ИППП. Вместе с тем проблема полноценного обследования и лечения больных остается весьма актуальной, и свидетельством тому являются неудачи терапии, хронизация инфекционного процесса, серорезистентность при сифилисе и др.
   Следует учитывать, что ИППП - не только медико-биологическая, но и социально значимая проблема, затрагивающая миллионы людей и в определенной степени представляющая угрозу национальному здоровью, и лишь тщательно продуманный научно обоснованный комплекс мероприятий, включая различные методы профилактики, поможет снизить уровень заболеваемости, избежать физических, материальных потерь и повысить качество жизни.
   Лабораторная диагностика наиболее распространенных и социально значимых ИППП должна основываться на принципах необходимости и достаточности и строго руководствоваться научно обоснованными, регламентированными технологиями.   

Таблица 1. Методы лабораторной диагностики патогенных возбудителей ИППП

1. Микроскопические:
• светооптическая (фазово-контрастная) и микроскопия в темном поле
• флюоресцентная микроскопия
• электронная микроскопия: трансмиссионная, сканирующая (используется преимущественно для научных исследований)
2. Серологические:
• комплекс серологических реакций (КСР): реакция микропреципитации (РМП) и ее варианты: VDRL, RPR, TRUST и дp. с кардиолипиновым антигеном и реакция связывания (фиксации) комплемента (РСК) - реакция Вассермана с двумя антигенами (кардиолипиновым и трепонемным)
• реакция иммунофлюоресценции (РИФабс и РИФ200) - см. флюоресцентная микроскопия
• реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) и ее модификации
• реакция пассивной гемагглютинации (РПГА или ТPPA - Treponema pallidum particles assay)
• иммуноферментный анализ (ИФА или ELISA) и его модификации в качественном и количественном вариантах, с определением cуммарных и раздельных иммуноглобулинов M и G
• линейный иммуноблоттинг и его модификации
3. Культуральные, в том числе культура клеток (тканей)
4. Молекулярно-биологические: ДНК-гибридизация, ПЦР-анализ, ЛЦР-анализ, SDA и др.
5. Иммунохроматографические и фермент-специфические (скрининговые)
Таблица 2. Контрольные образцы (материалы), оптимизирующие лабораторную диагностику ИППП

Нозология

Методы исследования

Тип образца (материала), производитель, распространитель

Основание

Сифилис

КСР (РМП, РСКк, РСКт), РПГА, ИФА, РИФ (РИФабс, РИФ200), РИТ

Лиофилизированные сыворотки крови(панель сывороток) - Вектор-Бест, МБС ФСВОК

Приказ МЗ РФ №87 (26.03.2001)
Методические рекомендации
Договор с ФСВОК

Гонорея

Микроскопия: окраска по Граму ПЦР-анализ

Микрофотограммы ФСВОК Лиофилизированные культуральные образцы ЦНИИЭ МЗ РФ, ФСВОК

Приказы МЗ СССР №936 и №1570
Методические рекомендации
Договор с ФСВОК

Трихомониаз

Микроскопия: окраска "синькой" и по Граму

Микрофотограммы ФСВОК

То же

Хламидиоз

ПИФ (нПИФ) - иммунофлюоресценция ПЦР-анализ
ИФА

Микрофотограммы ФСВОК
Лиофилизированные культуральные образцы ЦНИИЭ МЗ РФ
Лиофилизированные сыворотки крови ФСВОК

Приказ МЗ СССР №286
Методические рекомендации
Договор с ФСВОК

Микоуреаплазмоз

Культуральная (бактериологическая) диагностика ПИФ-иммунофлюоресценция ПЦР-анализ

Лиофилизированные культуральные образцы ЦНИИЭ МЗ РФ, ФСВОК

Методические рекомендации Договор с ФСВОК

Сифилис
   
Согласно приказу МЗ РФ №87 ИФА, РПГА, их варианты и модификации регламентированы при диагностике всех форм сифилитической инфекции. Предполагается постепенный переход от КСР (РМП и РСК) к новому комплексу МР (РМП и ее варианты: RPR, TRUST и др.) с ИФА или РПГА. Планируется следующий алгоритм обследования пациентов: при первичной диагностике пациентов целесообразна постановка РМП в количественном варианте (сыворотка, плазма, цельная кровь) и одной из специфических, диагностических методик: ИФА (для детекции суммарных и раздельных IgM и IgG) или РПГА. После окончания полноценной терапии предполагается постановка количественной РМП, и по снижению титра в 4 раза (на два разведения) делают заключение об элиминации из инфицированного организма T. pallidum и эффективности проводимой терапии. Окончательное заключение выносится не ранее чем через 1-1,5 года в случае замедленной негативации нетрепонемных тестов или отсутствия таковой, а также по клиническим данным. Следует использовать на всем протяжении обследования больного одни и те же серологические реакции и тест-системы одного производителя. Лишь по истечении этого периода и тщательного клинико-лабораторного обследования назначается дополнительная антибактериальная терапия средствами, ранее не использованными при лечении данного пациента. Такой подход, несомненно, унифицирует процедуру клинико-лабораторного обследования и ведения пациентов на всех этапах инфекционного процесса. Следует учитывать и объяснять пациентам, что негативация серологических реакций - процесс длительный - от нескольких месяцев до нескольких лет, и постоянное проведение сероконтроля вряд ли целесообразно и приводит к ненужным материальным и физическим потерям.
   Наряду с упомянутыми в приказе №87 методиками в настоящее время в России для диагностики сифилиса применяют иммуноблоттинг - линейный иммуноферментный анализ. Однако пока эта методика носит исследовательский статус, как и ПЦР-анализ, и требуется проведение широких сопоставительных исследований с целью установления места и роли этих диагностических процедур при сифилитической инфекции (приказ МЗ РФ №87; Г.А.Дмитриев, Н.В.Фриго, 2004). Осуществляется разработка по созданию ПЦР-анализа для детекции T. pallidum в различных локализациях, однако эта методология также носит пока лишь исследовательский статус.   

Гонорея и трихомониаз
   
До настоящего времени основополагающим комплексом лабораторной диагностики этих весьма распространенных ИППП является микроскопия мазков, окрашенных "синькой" и по методу Грама, а также нативного препарата (трихомониаз) в сочетании с культуральными исследованиями (приказы МЗ СССР №936 и №1570; Г.А.Дмитриев, 2003; Н.Н.Костюкова, В.А.Бехало, 2005). Целесообразно производить идентификацию представителей патогенных и непатогенных нейссерий с помощью экспресс-тестов, основанных на способности этих бактерий гидролизовать углеводы, находящиеся в питательной среде.
   Поскольку микроскопические методы исследования не обладают высокой чувствительностью, сложны для интерпретации, культуральная диагностика в большинстве случаев является необходимой для подтверждения диагноза гонореи и трихомониаза. Вместе с тем и она страдает рядом недостатков: занимает много времени, особенно в случае установления T. vaginalis, требует значительных затрат и высококвалифицированного персонала. ПЦР-анализ, разработанный для детекции возбудителей этих заболеваний и используемый в практике, не всегда коррелирует с клиническими проявлениями инфекций и не является строго регламентированным.   

Хламидиоз
   
Эта инфекция диагностируется с помощью различных методологий: иммунофлюоресценции (ПИФ и нПИФ), культуры клеток, молекулярно-биологического (ПЦР, ЛЦР, SDA и др.) и иммуноферментного анализов. Цитологические исследования, широко применяемые ранее, не обладают высокой чувствительностью при детекции возбудителя в мочеполовых органах и в настоящее время имеют лишь историческое значение.
   Диагностика хламидиоза базируется на применении не менее двух методов исследования: ПИФ/нПИФ с культурой клеток или ПЦР. В качестве отборочных (скрининговых) методик могут быть, при отсутствии централизованных лабораторий, использованы иммунохроматографический и фермент-специфический тесты. Результаты широко применяемых методов ИФА при хламидиозе следует сопоставлять с клиническими проявлениями и желательно проводить исследования парных сывороток с интервалом в 2-3 нед. Эта методика может применяться для измерения уровня антихламидийных IgG в семенной плазме, однако ее результаты носят преимущественно информативное, дополнительное значение в отсутствие культуральных исследований и ПЦР-анализа. Об этиологической излеченности свидетельствует отсутствие возбудителя в культуре клеток или в ПЦР-анализе не ранее 1-1,5 мес после окончания терапии.   

Мико- и уреаплазмоз
   
В лабораторной диагностике мико- и уреаплазмоза в силу особенностей морфологии (отсутствие клеточной стенки и чрезвычайно малых размеров) применяются в основном культуральный метод или ПЦР-анализ. Иммунофлюоресценция носит отборочный, скрининговый характер и трудна для интерпретации. Проблема осложняется еще и тем, что возбудители микоуреаплазмоза - в своем большинстве условно-патогенные микроорганизмы, и развитие заболевания зависит в определенной мере от "массивности" заражения. Поэтому является необходимым определение не только их наличия, но и концентрации/титра. Этому в полной мере соответствует культуральная методика с определением титра и чувствительности возбудителей к лекарственным препаратам. Установление этих микроорганизмов в титре более 104 КОЕ или ЦОЕ свидетельствует о развитии заболевания и необходимости назначения терапии. Амплификационные методологии также весьма эффективны при диагностике микоуреаплазмозов, однако с их помощью значительно труднее установить истинную чувствительность этих объектов к отдельным антибиотикам.   

ИППП вирусной этиологии
   
Для детекции возбудителей ИППП вирусной этиологии (герпес, цитомегаловирус, папиллома человека и др.) применяются в основном амплификационные методологии, с помощью которых не только решается вопрос об их наличии, но и осуществляется типирование, в том числе групп высокого онкогенного риска (папилломавирус человека - ПВЧ). Однако прямой метод детекции, к которым относят ПЦР-анализ, не всегда достаточен, так как даже установление вируса папилломы типа 16 или 18 не всегда свидетельствует о неотвратимости опухолевого роста и малигнизации. Дело в том, что ПВЧ может находиться в двух стадиях - транзиторной и интегральной. В первой из них, как правило, наблюдается элиминация вируса и выздоровление, что не требует серьезных клинических мероприятий. О наличии второй стадии свидетельствует появление в цервикальных пробах онкобелков Е6/Е7-маркеров онкогенеза и, таким образом, измерение его является чрезвычайно важным для ранней диагностики папилломатоза, а по снижению их уровня производится оценка эффективности терапии или положительной динамики опухолевого процесса (В.И.Киселев, О.И.Киселев, 2003; В.И.Киселев, 2004; Г.А.Дмитриев и соавт., 2004).
   Таким образом, создание высокотехнологичных, регламентированных методологий в рамках научно обоснованных алгоритмов обследования пациентов, несомненно, оптимизирует весь комплекс медицинских мероприятий, а также снизит материальные и физические затраты при постановке диагноза ИППП.



В начало
/media/gynecology/06_05/17.shtml :: Saturday, 14-Apr-2007 17:17:19 MSD
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster