Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

Сердечная недостаточность  
Том 1/N 1/2000 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Влияние генов,отвечающих за синтез кардиальных белков актина и дистрофина, на развитие хронической сердечной недостаточности у больных с инфарктом миокарда и дилатационной кардиомиопатией


С.Н. Терещенко*, Н.А. Джаиани*, В.Ю. Мареев **, Ф.Т. Агеев **, Н.Н. Левчук *, Г.О. Шайхаев ***, В.С. Моисеев *

* Кафедра внутренних болезней РУДН ** Кардиологический научный центр РАМН ***Лаборатория экологической и радиационной генетики Института биологии гена РАН.

Для понимания механизмов развития и прогрессирования хронической сердечной недостаточности (ХСН) научные исследования последних лет сосредоточиваются на оценке вклада генетических факторов в развитие недостаточности кровообращения. Это является перспективным подходом в связи с тем, что выявляется генетический риск и происходит прогнозирование осложнений заболевания до появления их клинических проявлений [1, 2]. Так, в настоящее время на молекулярном уровне рассматривается патогенез кардиомиопатий, поскольку происходит нарушение в процессе экспрессии генов, в частности механизмов претрансляции, трансляции и посттрансляции, что ведет к изменению фенотипа [2]. Известны работы по выявлению генетических факторов развития ХСН у больных с дилатационной кардиомиопатией (ДКМП), в частности у этих больных выявлялись мутации в различных участках генов, отвечающих за синтез белков дистрофина и актина [3, 4, 5, 6].
   В литературе отсутствуют сообщения о мутации гена дистрофина и актина у больных с инфарктом миокарда, хотя можно предположить, что аналогичная мутация возможна под влиянием стресса и активации нейрогуморальных механизмов.
   В связи с этим целью работы явилось исследование генов актина и дистрофина и у больных с идиопатической ДКМП, и у лиц, перенесших инфаркт миокарда.   

Материалы и методы

   В исследование включено 130 больных, из них 104 мужчин и 26 женщин, в возрасте от 21 до 88 лет. Больные были разделены на три группы: 1-я группа - больные острым крупноочаговым и трансмуральным инфарктом миокарда, осложнены ХСН II - IV ФК по NYHA, 2-я группа - с инфарктом миокарда без клинических признаков сердечной недостаточности, 3-я группа - больные идиопатической ДКМП с ХСН II - IV ФК. Группу контроля составило 30 человек, из них 21 мужчин и 9 женщин, в возрасте от 25 до 76 лет (средний возраст 55,5 лет) без сердечно-сосудистой патологии и не имеющих тяжелых хронических заболеваний.
   Клинико-демографическая характеристика больных представлена в таблице.
   Исследование генов актина и дистрофина производилось в Институте общей генетики, в лаборатории экологической и радиационной генетики Института биологии гена РАН.
   Для выделения ДНК была использована цельная кровь, взятая в пробирку с ЕДТА с конечной концентрацией 50mM или цитратом с конечной концентрацией 0,5%. Выделение ДНК проводили с
использованием набора реагентов “DiatomTMDNA Prep 200” (фирма “Biokom”). В основе выделения ДНК с помощью данного набора лежит использование лизирующего реагента с гуанидинтиоционатом и сорбента ДНК “Nucleos”. В присутствии высоких концентраций гуанидинтиоционата (4M) ДНК активно сорбируется на поверхности частичек “Nucleos”, а остальные компоненты крови остаются в среде, которые затем удаляются центрифугированием. ДНК, промытая спиртосолевым буфером, затем смывается с сорбента ЭкстраГеном, смесью ионообменников и напрямую используется для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделения ДНК из цельной крови проведены в соответствии с инструкцией использованного набора “DiatomTMDNA Prep 200” фирмы “Biokom”.
   Для обнаружения мутации в гене кардиоактина использовали метод PCR-RFLP, согласно которому продукт ПЦР режется соответствующей рестриктазой, узнающей интересующую точечную нуклеотидную замену. Рестриктаза Bcl I с сайтом рестрикции (-TGATCA-) выявляет миссенс мутацию G (норма) на А (мутация) в 5-лс экзоне гена кардиоактина, связанная с идиопатической дилатационной кардиомиопатией. Синтез праймеров для исследования 5-м экзона кардиоактина был проведен на синтезаторе PE Applied Biosystems (США). Состав праймеров: F 5/-gactcgttcccaggtatg R 5
/-gatctcccactcacaaaag.
   Постановку ПЦР проводили в следующем режиме амплификации: 950С - 40 с, 580С - 30 с, 740С - 40 с по 30 циклов.
   Размер амплифицированного фрагмента 222 пары нуклеотидов. Конечные концентрации реакционной смеси ПЦР: 67 mM Трис
Hcl c pH = 8,8, 16 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20,1 ед. Taq.полимеразы, 200mM dNTP каждого, 0,5 mM праймеров каждого 10-20ng ДНК исследуемой, 1,5 mM MgCl2, конечный объем PCR смеси 30 мкл.
   Для анализа результатов амплификации 10 мкл ПЦР продукта наносили на 2% агарозный гель-электрофорез. ДНК в геле проявляли с бромистым этидием в УФ-свете длиной волны 32 нм. После визуальной оценки концентрации PCR продукта определяли объем PCR смеси, необходимой для постановки реакции рестрикции (от 5 до 10 мкл PCR
смеси).

Исследование гена дистрофина

   Для обнаружения мутации в гене дистрофина использовали метод ПЦР с сиквенсспецифическими праймерами (PCR-SSP), согласно которому для проведения ПЦР используется пара праймеров, один из которых содержит одну или две точечные замены. Одна из замен представляет собой интересующую точечную нуклеотидную замену. Принцип метода заключается в том, что при оптимальной температуре отжигаются праймеры при отсутствии мутации и появляется специфическая полоса ПЦР продукта, а в случае мутации при той же температуре праймеры не отжигаются и реакция амплификации не проходит. Выбранные две пары сиквенсспецифических праймеров предназначены для обнаружения миссенс мутации A на G в 9-м экзоне гена дистрофина нормальной последовательности и с мутацией, соответственно связанная с Х-сцепленной идиопатической ДКМП.
   Синтез праймеров для исследования 5-го экзона кардиоактина был проведен на синтезаторе PE Applied Biosystems (США).
   Состав праймеров: Dn 5-gta aat gtt gac aga cct gtg 5-gaa cct ctc tcg cag atc acg Dm 5-gta aat gtt gac aga cct gtg 5-gga tcc tct ctc gca gat cgc a
   Постановку ПЦР проводили в следующем режиме амплификации: 950С - 40 с, 560С - 30 с, 740С - 40 с по 35 циклов.
   Размер амплифицированного фрагмента 160 пар нуклеотидов. Конечные концентрации реакционной смеси ПЦР: 67 mM Трис Hcl c pH = 8,8; 16 mM (NH
4)2SO4, 0,01% Tween 20,1 ед. Taq полимеразы, 200mM dNTP каждого, 0,5 mM праймеров каждого 10-20ng ДНК исследуемой, 1,5 mM MgCl2, конечный объем ПЦР смеси 30 мкл.
Таблица. Клинико-демографическая характеристика больных.

Показатель Группа 1 (n - 59) Группа 2 (n - 51) Группа 3 (n - 20)
Женщины

9

11

3

Мужчины

50

40

17

Средний возраст

59,5 + 1,66

61,0 + 1,68

42,9 + 2,32

Локализация инфаркта миокарда:
- Передний

36 (61%)

27 (53%)

 
- Задний

21 (35,6%)

20 (39%)

 
- Циркулярный

2 (3,4%)

4 (8%)

 
Тяжесть ХСН ФК:
- II

15 (25,4%)

 

8 (40%)

- III

35 (59,3%)

 

11 (55%)

- IV

9 (15,3%)

 

1 (5%)

 
Гипертоническая болезнь

32 (54%)

28 (55%)

 
Сахарный диабет II типа

13 (22%)

6 (11,8%)

 
Мерцательная аритмия

8 (13,6%)

 

6 (30%)

Фракция выброса, %

33,0 +1,1

42,3 + 0,7

29,6 +1,9

   Для анализа результатов амплификации 10 мкл ПЦР продукта наносили на 2,5% агарозный гель-электрофорез. ДНК в геле проявляли с бромистым этидием в УФ-свете длиной волны 320 нм.
   Для выявления точковой мутации в исследуемых пробах регистрируют наличие или отсутствие амплифицированного фрагмента с соответствующей парой праймеров:
   1. Наличие ПЦР фрагмента длиной в 160 пар нуклеотидов при амплификации с парой праймеров для нормальной последовательности указывает на норму.
   2. Отсутствие ПЦР фрагмента длиной в 160 пар нуклеотидов при амплификации с парой праймеров для нормальной последовательности указывает на наличие предполагаемой мутации.
   3. Наличие ПЦР фрагмента длиной в 160 пар нуклеотидов при амплификации с парой праймеров для последовательности с мутацией подтверждает наличие мутации.   

Результаты и их обсуждение

   Как указывалось, в литературе отсутствуют сообщения о мутации гена дистрофина и актина у больных с ишемической болезнью сердца, в частности с инфарктом миокарда, хотя под влиянием нейрогормонов и других биологически активных веществ, которые активизируются в ответ на повреждение сердечной мышцы (в данном случае при инфаркте миокарда), возможно предположить аналогичную мутацию. Однако, несмотря на правильные теоретические предпосылки и наши ожидания, мутации этих генов у исследуемых больных выявлено не было. Более того, не определялась мутация и в группе больных с ДКМП, хотя в последние годы в результате ряда исследований получены достаточно значимые результаты, которые касаются связи мутации генов дистрофина и актина с сердечной недостаточностью. В частности, R. Ortiz-Lopez и соавт. [2] исследовали геномную ДНК в 3 неродственных семьях с Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатией. Группа контроля включала 50 лиц женского и 50 мужского пола, не являющихся родственниками. Для амплификации ДНК использовали ПЦР. В результате исследования в одной из семей с Х-сцепленной ДКМП была выявлена мутация гена, кодирующего дистрофин, локализующегося в 21-й хромосоме, в частности найдена замена аденина на гуанин в экзоне 9 в позиции 1043, что привело к синтезу гидрофобной неполярной аминокислоты аланина вместо гидрофильного полярного треонина, находящегося в дистрофине в позиции 279, относящейся к N-концу белка дистрофина. Замена треонина на аланин ведет к изменению полярности N-конца белка и, следовательно, к изменению вторичной и третичной структуры дистрофина. Таким образом, данная мутация является причиной потери мембраностабилизирующей функции этого белка и нарушения функциональной активности кардиомиоцита, что и приводит к Х-сцепленному дегенеративному заболеванию миокарда - Х-сцепленной ДКМП.
    F. Muntoni и соавт. [4], а также J. Milasin и соавт. [5] описывали мутации в других участках гена дистрофина. Эти участки были исследованы R. Ortiz-Lopes и соавт. [3] в тех же 3 семьях с Х-сцепленной ДКМП, мутации в этих участках выявлено не было. Следовательно, можно думать о различных механизмах, ведущих к развитию дистрофинопатий.
   Таким образом, любая мутация гена дистрофина приводит к дефициту этого миокардиального белка, что является причиной отсутствия в миокарде дистрофинассоциированных гликопротеидов [7, 8], отвечающих за связывание мультипротеинного комплекса с белками экстрацеллюлярного матрикса. Результатом этого является дезорганизация кардиомиоцитов, ведущая к изменению механической модели миокарда, нарушению его насосной функции и ХСН.
   Что касается мутации кардиального актина, то в 1998 г. опубликована работа T. Оlson и соавт. [6],
продемонстрировавшая исследование двух не родственных семей с аутосомно-доминантной идиопатической кардиомиопатией (одна семья немецкого происхождения, вторая - шведско-норвежского). Для всех членов проводились эхокардиографическое исследование, биопсия миокарда, выявившая характерные для ДКМП признаки (фокальный интерстициальный фиброз и гипертрофию кардиомиоцитов). Для обнаружения мутации в гене актина использовалась ПЦР. Выявлены две одиночные мутации этого гена: одна - в 5-м экзоне гена кардиоактина (замена гуанина на аденин, что приводит к кодированию синтеза гистидина в 312-м положении вместо аргинина), другая - в 6-м экзоне (замена аденина на гуанин, следствием чего явился синтез в 361-м положении глицина вместо глутамина). Но можно было бы эти замены рассматривать в рамках полиморфизма гена кардиоактина. Для исключения такого предположения протестированы 435 неродственных людей, описанной мутации выявлено у них не было. Следовательно, указанные варианты гена актина ассоциируются именно с идиопатической ДКМП.
   То, что в нашей работе не выявлялась мутация генов актина и дистрофина, не является прямым утверждением того, что мутации действительно нет. Возможно, мутация происходит в более поздние сроки заболевания? Следует отметить, что в нашем исследовании не проводилось генетического анализа в семьях с идиопатической ДКМП, а были взяты неродственные люди. Вероятно, для глубоких выводов необходимо также большое в популяционном плане исследование. И, может, не менее значимым было бы исследование генов других структурных компонентов сердечной мышцы, в частности коллагена и эластина, мутация которых, возможно, тоже имеет значение в развитии ХСН.

Литература:
   1. Tерещенко С. Н. Клинико-патогенетические и генетические аспекты хронической сердечной недостаточности и возможности медикаментозной коррекции. / Дисс. … д-ра. мед. наук. - М. 1998; 287.
   2. Bristow M.R. Why does the myocardium fail? Insights from basic science. // Lancet 1998; 352: 8-14.
   3. Ortiz-Lopez R., Li H., Su J., Goytia V., Towbin J.A.
Evidence for a dystrophin missense mutation as a cause of X-linked dilated cardiomyopathy. //Circulation 1997; 95: 2434-40.
   4. Muntoni F., Cau M., Ganau A., Congiu R., Arvedi G., Mateddu A., Marrosu M.G., Cianchetti C., Realdi G., Cao A., Melis M.A. Brief report: deletion of the dystrophin muscle-promoter region associated with X-linked dilated cardiomyopathy. // N. Engl. J. Med 1993; 329: 921-5.
   5. Milasin J., Muntoni F., Severini G.M., Bartoloni L., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C., Camerini F., Falaschi A., Mestroni L., Giacca M. and HMD Study Group. A point mutation in the 5' splice site of the dystrophin gene first intron responsible for X-linked dilated cardiomyopathy.// Hum. Mol. Genet. 1996; 5: 73-9.
   6. Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N., Tai Y.S., Keating M.T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. // Science. 1998; 280: 750-2.
   7. Bies R.D., Maeda M., Roberds S.L., Holder E., Bohlmeyer T., Young J.B., Campbell K.P. A 5' dystrophin duplication mutation causes membrane deficiency of alpha-dystroglycan in a family with X-linked cardiomyopathy. // J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 3175-88.
   8. Franz W.M., Cremer M., Herrmann R., Grunig E., Fogel W., Scheffold T., Goebel H.H., Kircheisen R., Kubler W., Voit T. et al. X-linked dilated cardiomyopathy. Novel mutation of the dystrophin gene. // Ann NY Acad. Sci. 1995; 752: 470-91.
   



В начало
/media/heart/00_01/18.shtml :: Wednesday, 05-Jul-2000 22:03:29 MSD
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster