Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

ИНФЕКЦИИ И АНТИМИКРОБНАЯ ТЕРАПИЯ  
Том 3/N 5/2001 В ПОМОЩЬ КЛИНИЧЕСКОМУ МИКРОБИОЛОГУ

Микробиологическая диагностика инфекций нижних дыхательных путей нетуберкулезной этиологии на современном этапе развития клинической микробиологии


С.Д.Митрохин

Городская клиническая онкологическая больница № 62, Москва

Введение
   
Инфекции нижних дыхательных путей – это инфекции, возникающие на уровне ниже глотки, т.е. в трахее, бронхах или легочной ткани (трахеиты, бронхиты, легочные абсцессы, пневмонии). Иногда при пневмонии в процесс вовлекается плевра, в результате чего возникает ее поражение (плеврит), иногда в плевральной полости может образоваться жидкость (плевральный выпот).
   Ниже приводится современный протокол микробиологического исследования отделяемого нижних дыхательных путей [1].
   Исследуемым материалом являются: мокрота – неинвазивный метод; содержимое бронхов (лаваж), щеточные соскобы (brushings), аспираты и пунктаты из трахеи, легочная ткань (пункция и/или биопсия) – инвазивные методы.   

Микробиологическое понятие "норма"
   
В норме мокрота человека может быть контаминирована представителями нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей.
   Время проведения исследования 4–5 дней.
   Возбудителями гнойно-воспалительных процессов нижних отделов дыхательного тракта могут быть бактерии, микоплазмы, вирусы, риккетсии, грибы и простейшие.
   Согласно рекомендациям ВОЗ все наиболее часто встречающиеся патогены разделены по уровням приоритетности [1]:
   - Патогены высокого уровня приоритетности
   (кроме
Mycobacterium tuberculosis)
   Streptococcus pneumoniae
   Hemophilus influenzae
   Staphуlococcus aureus
   Klebsiella pneumoniae

   - Патогены среднего уровня приоритетности
   Энтеробактерии
   Candida albicans
   Branhamella catarrhalis

   Все другие микроорганизмы –
Pseudonomas aeruginosa, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp. и др. относятся к патогенам низкого уровня приоритетности.    

Оценка результатов
   
Для разделения нормальной симбиотической микрофлоры верхних дыхательных путей (контаминирующей мокроту) от микрофлоры – этиологического агента гнойно-воспалительного процесса – используется целый комплекс тестов. Так, например, с помощью количественного метода определяют содержание в мокроте определенного вида микроорганизма, исходя из того, что возбудитель находится в материале в значительно большем количестве, чем микробы – симбионты человека. Критическое число составляет 1•106 – 1•107.
   Определенное значение имеет вид выделенного микроорганизма. Streptococcus gr. viridans, Corynebacterium spp., Neisseria spp., Staph
ylococcus spp. (кроме возбудителей дифтерии и менингита) составляют нормальную микрофлору носоглотки и ротоглотки, поэтому как возбудителей инфекции их следует учитывать только у имунокомпрометированных пациентов тогда, когда их количество превышает обычное и сохраняется при повторных исследованиях.
   При неинвазивном методе забора материала для получения достоверного результата немаловажное значение имеет взятие проб мокроты.
   Далее приведены правила взятия биоматериала (мокроты) для медицинского персонала лечебно-профилактических учреждений [1].   

Таблица 1. Набор дисков с антибактериальными препаратами и диаметр зон ингибирования роста для определения чувствительности штаммов стафилококка при отрицательном результате определения бета-лактамаз

Антибактериальный препарат

Диск/ концентрация

Диаметр ингибирования зон

R

I

S

Оксациллин

ОХ/1

<10

11-12

>13

Бензилпенициллин

P/1O

<28

-

>29

Ампициллин

AM/10

<28

-

>29

Цефазолин

CZ/30

<14

15-17

>18

Примечание. Здесь и в табл. 2: R - устойчивые; I - промежуточные; S - чувствительные.

Таблица 2. Набор дисков с антибактериальными препаратами и диаметр зон ингибирования роста для определения чувствительности штаммов стафилококка при положительном результате определения бета-лактамаз

Антибактериальный препарат

Диск/ концентрация

Диаметр ингибирования зон

R

I

S

Оксациллин

ОХ/1

<10

11-12

>13

Эритромицин

E/15

<13

14-22

>23

Клиндамицин

CM/2

<14

15-20

>21

Ко-тримоксазол

CXT

<10

11-15

>16

Фузидиевая кислота

FA/10

<15

16-21

>22

Ванкомицин

VA/30

-

-

>15

Амоксициллин/клавуланат

AmC/30

<19

-

>20

Цефуроксим

CXM/30

<14

15-22

>23

Посев на флору и чувствительность к антибиотикам
   
До еды, после полоскания зева и полости рта теплой водой или раствором питьевой соды (1 чайная ложка на стакан воды). Отхаркиваемую мокроту (лучше первую утреннюю порцию) собирают в стерильный контейнер с крышкой (взять в баклаборатории). Если мокрота отделяется плохо, накануне пациенту дают отхаркивающие средства.
   Примечание
   1. Признаки правильно собранной мокроты – мокрота должна быть (или/или):
   - гнойной зеленой;
   - гнойной желтой;
   - слизисто-гнойной (т.е. частично гнойной, частично слизистой);
   - с прожилками крови;
   - с прожилками крови и зелеными включениями.
   2. Признаки неправильно собранной мокроты (мокроты, содержащей в основном секреты ротовой полости и глотки) – мокрота представляет собой (или/или):
   - серую слизистую;
   - серую пенистую;
   - белую слизистую;
   - белую пенистую;
   - белую слизистую с частицами пищи;
   - водянистую (т.е. присутствует лишь слюна);
   - водянистую с частицами пищи.
   Пробы мокроты, описанные в п.2, не подвергаются исследованию в баклаборатории на наличие инфекции нетуберкулезной этиологии. Анализ следует повторить.   

Микроскопическое исследование
   
При микроскопическом исследовании опытный врач-бактериолог может дать предварительный ответ об идентифицируемом микроорганизме. Пробу гнойной или гнойно-слизистой мокроты используют для приготовления мазка, который окрашивают по методу Грама:
   - Грамположительные диплококки, окруженные непрокрашенной капсулой – вероятно, являются пневмококками?
   - Мелкие грамотрицательные коккопалочки или палочки – Hemophilus influenzae?
   - Грамотрицательные диплококки, расположенные интра- или экстрацеллюлярно – бранхамеллы (моракселлы)?
   - Грамположительные кокки в виде виноградной грозди – золотистый стафилококк?
   - Грамотрицательные палочки – энтеробактерии или псевдомонады?
   - Большие грамположительные клетки,часто с мицелием – дрожжеподобные грибы?
   Культивирование
   Отбирают хлопьевидные включения из пробы гнойной мокроты (или из материала, более всего приближенного к ней) и высевают на различные питательные среды. Рекомендуемый минимальный набор для культивирования:
   - Кровяная среда с диском оптохина в центре питательной среды.
   - Шоколадный агар с/без селективной добавкой для гемофильной палочки.
   - Агар Мак-Конки/ среда Эндо.
   Для проб мокроты, в которой при окрашивании по методу Грама обнаружены грамположительные кокки в форме виноградной грозди, в набор добавляют чашку с манитол-солевым агаром или желточно-солевым агаром (среда Чистовича). Наличие в окрашенном мазке грамположительных дрожжеподобных структур служит основанием добавить в набор среду Сабуро.
   Для выделения культуральным методом таких микроорганизмов, как легионеллы и микоплазмы, можно использовать специальные селективные дифференциально-диагностические среды – BCYE для легионелл (максимальное время инкубации для получения отрицательного ответа 14 дней) и PPLO для микоплазм (максимальное время инкубации для получения отрицательного ответа 21 день).   

Определение чувствительности к антибиотикам
   
Используют стандартный диско-диффузионный метод, предложенный Керби и Бауэром (метод Керби – Бауэра) [1, 3].
   В качестве примера приводим рекомендуемый набор дисков с антибиотиками и критерии учета полученных результатов для стафилококков (табл. 1, 2) [3].
   Средой для постановки теста на чувствительность является среда Мюллера – Хинтона с добавлением 4 – 5% NaCl [3].
   Для определения чувствительности стафилококков предварительно проводят определение наличия/отсутствия у тестируемого штамма ферментов, получивших название "бета-лактамаз" – диск с нитроцефином (BBL, США). При отсутствии данных ферментов используют диски.
   При наличии у тестируемого штамма данных ферментов необходимо использовать диски, представленные в табл. 2.
   Предлагаемый подход к тестированию чувствительности штаммов стафилококка важен для правильной интерпретации полученных результатов чувствительности :
   1. При отсутствии бета-лактамазообразования и сохранении чувствительности к оксациллину препаратами выбора являются природные аминопенициллины и цефалоспорины I поколения.
   2. При наличии бета-лактамазообразования и сохранении чувствительности к оксациллину препаратами выбора являются оксациллин, защищенные пенициллины, цефалоспорины II поколения.
   3. При наличии бета-лактамазообразования и отсутствии чувствительности к оксациллину бета-лактамные антибиотики (включая карбапенемы) являются клинически не эффективными. Применяются препараты других групп.   

Стрептококки (в том числе пневмококк)
   
Для этих микроорганизмов метод Керби – Бауэра имеет свои ограничения:
   1. Он корректен лишь для пневмококка. И только в том случае, если тот показывает чувствительность к оксациллину (нагрузка 1 мкг). В случае снижения чувствительности к оксациллину необходимо использовать метод Е-теста или серийных разведений.
   2. При использовании метода Керби – Бауэра для тестирования стрептококков в среду Мюллера – Хинтона необходимо добавлять 5% бараньей крови
/эритроцитов.
   3. Стрептококки группы "viridans" не рекомендуется тестировать на чувствительность к антибиотикам этим методом из-за отсутствия воспроизводимых результатов.
   Псевдомонады и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии
   Ограничения диско-диффузионного метода:
   1. Стандартизован лишь для синегнойной палочки и бактерий рода Аcinetobacter.
   2. При исследовании чувствительности других псевдомонад и неферментирующих грамотрицательных бактерий необходимо использовать Е-тест или метод серийных разведений.
   Гемофильные палочки
   Ограничения диско-диффузионного метода:
   Для постановки чувствительности диско-диффузионным методом должна использоваться специальная среда – HTM (
Haemophilus Test Medium).
   Дрожжеподобные грибы рода Кандида и др.
   Ограничения диско-диффузионного метода:
   1. Используется специальные среды – казитоновый агар и полусинтетический агар для тестирования грибов.
   2. Более достоверные результаты получаются при использовании метода серийных разведений.
   Таким образом, резюмируя сказанное, можно сделать следующие выводы:
   При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов энтеробактерий и стафилококков рекомендуется использовать метод Керби – Бауэра.
   При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов стрептококков (в том числе пневмококка), неферментирующих грамотрицательных палочек, гемофильных палочек и дрожжеподобных грибов рекомендуется использовать коммерческие тест-системы ("стрипы"), представляющие собой набор тех или иных антибиотиков, представленных в двух концентрациях. Это метод (breakpoint) позволяет избежать трудоемкости стандартного метода серийных разведений, но не теряет при этом его главного достоинства – количественного определения минимальной
подавляющей концентрации препарата, соответствующей терапевтической концентрации антибиотика в организме.
    Отдельно хотелось бы остановиться на микробиологической диагностике легионелл, микоплазм и хламидий.
   Легионеллезы в настоящее время микробиологически диагностируются с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) на определение антигена.
   Первичная атипичная пневмония (микоплазменная) также микробиологически подтверждается с помощью ИФА выявление антител (IgG , IgM).
   Хламидийные пневмонии диагностируются микробиологически как РИФ, так и ИФА (антигены и антитела (IgG)).   

Литература

1. Vandepitte J, Engbaek K, Piot P, Heuck CC. Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии/Пер. с англ. Женева. ВОЗ, 1994; 43-51, 117-8.
2. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений//Приказ Минздрава СССР №535 от 22.04.1985.
3. Сидоренко С.В., Колупаев В.Е. Антибиотикограмма: диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов. М., Sanofi Pasteur, 1999; 32.



В начало
/media/infektion/01_05/156.shtml :: Wednesday, 30-Jan-2002 20:21:36 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster