Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

ИНФЕКЦИИ И АНТИМИКРОБНАЯ ТЕРАПИЯ  
Том 4/N 1/2002 ПРАКТИЧЕСКОМУ ВРАЧУ О КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Микробиологическая диагностика инфекций кровяного русла на современном этапе развития клинической микробиологии


С.Д. Митрохин

Городская клиническая онкологическая больница №62, Москва

Введение
   
В норме кровь стерильна. Исследование крови проводят при заболеваниях, связанных с проникновением микроорганизмов в ток крови, – у больных с длительной лихорадкой неясного генеза. Следовательно, бактериемия и фунгиемия всегда являются патологией. Сепсис – бактериемия, вызванная тяжелой инфекцией, клинически проявляется как сильный озноб, лихорадка, токсикоз и гипотензия. Высшая форма проявления бактериемии – шок [1].
   Причины бактериемии
   – Транзиторная бактериемия – менингиты, пневмонии, пиелонефриты, остеомиелиты, артриты, перитониты, холециститы, энтероколиты, травмы или хирургические (раневые) инфекции, открытые поражения кожи, язвы и др. Транзиторная бактериемия может быть результатом различных хирургических манипуляций, но всегда купируется спонтанно при отсутствии у больного иммунодефицита.
   – Бактериемия является характерной особенностью течения брюшного тифа, бруцеллеза, лептоспироза.
   – Длительная бактериемия характерна для эндоваскулярных инфекций (эндокардит, инфицированная аневризма, тромбофлебит).
   – Бактериемия и фунгиемия могут развиться при использовании лекарственных препаратов, применяемых внутривенно. В этом случае они наиболее часто обусловлены "оппортунистическими" микроорганизмами.
   Таким образом, септициемия и бактериемия (фунгиемия) могут быть вызваны практически всеми микроорганизмами: как патогенными, так и "оппортунистическими" бактериями и грибами [2].
   В табл. 1 приведены наиболее значимые в возникновении бактериемии и фунгиемии микроорганизмы и грибы.
   Оценка результатов зависит от вида выделенного микроорганизма и массивности его роста. Выделение патогенных микроорганизмов, безусловно, говорит об их этиологической роли в заболевании. В том случае, когда из крови выделены представители группы "оппортунистических" бактерий и грибов, следует учитывать их количественное содержание, наличие монокультуры или ассоциации, повторность выделения одной и той же культуры от больного и идентичность гемокультуры с культурами, выделенными из другого биологического материала от этого же больного.
   Согласно рекомендациям ВОЗ все наиболее часто встречающиеся патогены разделены по уровням приоритетности [2]:
   Патогены высокого уровня приоритетности
   – Сальмонеллы
   – Другие грамотрицательные энтеробактерии
   – Менингококки
   – Стрептококки – пиогенный, пневмококк, зеленящие
   Патогены среднего уровня приоритетности
   – Гемофильная палочка
   – Бактероиды
   – Синегнойная палочка

Патогены низкого уровня приоритетности
   – Candida albicans и Cryptococcus neoformans
   – Бруцеллы
   – Pseudomonas pseudomallei
   – Другие неферментирующие грамотрицательные бактерии, кроме синегнойной палочки
   Далее приводится современный протокол микробиологического исследования крови [2].

Таблица 1. Микроорганизмы, являющиеся этиологическими агентами инфекций кровяного русла [6]

Грамотрицательные

Грамположительные

Escherichia coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Salmonella typhi
Salmonella spp., отличные от
Salmonella typhi
Pseudonomas aeruginosa
Neisseria meningitidis
Haemophylus influenzae
Bacteroides fragilis (анаэроб)
Brucella spp.
Pseudomonas pseudomallei

Staphylococcus aureus
S. epidermiditis
Aльфа-гемолитические стрептококки
Streptococcus pneumoniae
E. faecalis (серогруппа D)
S. pyogenes (серогруппа А)
S. agalactiae (серогруппа В)
Listeria monocytogenes
Clostridium perfrin
gens (анаэроб)
Peptococcus spp. (анаэробы)
Peptostreptococcus spp. (анаэробы)
Candida albicans
Candida spp.
Cryptococcus neoformans

Таблица 2. Правила забора крови у взрослых пациентов для посева на флору и чувствительность к антибиотикам

В процедурном кабинете медперсонал проводит венопункцию локтевой вены. Кожу перед пункцией обрабатывают спиртовой настойкой йода, а затем спиртом. В шприц набирают 10 мл крови, посев осуществляют во флаконы со средой для гемокультуры. Порядок следующий:
снять защитную крышку с флакона для гемокультуры (не снимать резиновую пробку флакона!);
протереть резиновую пробку тампоном, смоченным спиртом;
сменить на шприце иглу. Проколов иглой резиновую пробку, засеять во флакон кровь, осторожно спуская ее по стенке флакона;
протереть резиновую пробку флакона тампоном, смоченным спиртом;
надеть защитную крышку и отправить в лабораторию.

Взятие проб крови (выбор времени взятия крови)
   
По возможности взятие проб крови следует проводить до назначения антибиотиков. Если больной уже получает антибактериальную терапию, кровь следует забирать непосредственно перед очередным введением препарата. Лучше всего брать пробы крови в то время, когда у пациента наблюдается озноб или пик температурной реакции. Необходимым минимумом забора являются две пробы, взятые из разных рук с интервалом 30 мин. Оптимальным является забор (в течение 1 ч) трех проб крови из разных вен, что значительно повышает вероятность выделения возбудителя. Большее количество проб не имеет преимуществ перед троекратным забором в плане частоты выделения микроорганизмов [3].
   Преимущества повторного взятия проб крови:
   – Снижение риска упустить транзиторную бактериемию.
   – Возможность подтверждения этиологической роли выделенной из крови "оппортунистической" микрофлоры (например, Staphylococcus epidermidis), если эта микрофлора обнаруживается во множестве проб венозной крови.
   Кровь для исследования забирают из периферической вены. Не показано преимуществ забора крови из артерии.
   Не допускается забор крови из катетера! Исключением из этого правила являются случаи подозрения на катетер-ассоциированные инфекции. При этом проводят сравнительное исследование образца крови из интактной периферической вены с образцом, полученным через подозрительный катетер. Если из обоих образцов выделяется один и тот же микроорганизм, то катетер, по всей видимости, является источником бактериемии.   

Количество крови
   
Поскольку количество бактерий в 1 мл крови всегда незначительно, очень важно взять достаточное количество крови: у взрослых – 10 мл крови из вены; у детей – 2–5 мл; у новорожденных и детей неонатального периода чаще можно получить не более 1–2 мл крови.   

Дезинфекция кожи
   
Участок кожи над веной, откуда будут брать кровь, должен быть тщательно обработан с помощью бактерицидного препарата: настойки йода, 10% поливидон-йоданата, 70% спирта или 0,5% хлоргексидина в 70% спирте. Дезинфектант должен испариться с поверхности кожи до взятия пробы крови. Если использовалась йодная настойка, ее следует стереть 70% спиртом для того, чтобы избежать раздражения кожи.
   Даже после тщательной обработки кожных покровов некоторые бактерии остаются в глубоких слоях кожи и могут проникнуть в образец крови, например, S. epidermidis, Propionibacterium acnes и даже споры клостридий. Псевдобактериемия (ложноположительные находки микробов в крови) может быть обусловлена использованием контаминированных антисептических растворов, шприцев или игл. Другим источником контаминации является контанкт иглы с нестерильной ампулой (флаконом), если тот же самый шприц использовали вначале для химических анализов крови или им проводили манипуляции для определения скорости оседания эритроцитов.
   Все изложенное кратко суммировано в табл. 2, в которой приведены правила взятия крови у взрослых пациентов медицинским персоналом лечебно-профилактических учреждений [4].   

Питательная среда для культивирования крови
   
Как правило, при приготовлении флаконов для культивирования образцов крови используют жидкую питательную основу, которая должна обеспечить наилучшие условия роста всех видов клинически значимых бактерий и грибов. В настоящее время ВОЗ рекомендует использовать для этих целей триптиказосоевый бульон (ТСБ), а наши нормативы [1] допускают использование и других питательных сред.
   Количество питательной основы
   Для того чтобы разбавить присутствующие в крови антибиотики и уменьшить бактерицидный эффект человеческой сыворотки, кровь смешивают с бульоном в соотношении 1:10 (10 мл крови и 100 мл бульона).   

Флаконы для культивирования крови
   
Отдельно следует остановиться на флаконах, используемых в настоящее время для культивирования образцов крови. Их можно условно разделить на две группы:
   1. Флаконы, приготавливаемые в лаборатории.
   2. Флаконы, приготавливаемые в производственных условиях (коммерческие).
   При приготовлении флаконов, относящихся к первой группе, из сухой основы питательной среды получают бульон, которым заполняют флаконы и затем наполовину закрывают крышками, сверху крышки покрывают квадратиками алюминиевой фольги или крафт-бумаги. Флаконы помещают в автоклав на 15 мин при температуре 121°C. Немедленно после автоклавирования, пока еще среда остается горячей, осторожно плотно закрывают флаконы крышками, не снимая с них фольгу или крафт-бумагу (в противном случае крышки окажутся не стерильными). Как только среда остынет, во флаконе образовывается неглубокий вакуум, который будет способствовать проницаемости мембран (крышек) для образцов крови. Верхнюю часть крышки следует осторожно продезинфицировать до инокуляции флакона. Если питательная среда окажется мутной, она не подлежит использованию.
   Для выделения из образца крови только аэробных бактерий (например, Pseudomonas spp., Neisseria spp.) или грибов, флаконы следует разгерметизировать, как только они будут доставлены в лабораторию. В этом случае следует проткнуть предварительно простерилизованную мембрану (крышку) иглой, снабженной ватно-марлевой заглушкой.
   При исследовании образца крови на бруцеллы и другие медленно растущие микроорганизмы рекомендуется использовать так называемые двухфазные флаконы, которые заполнены бульоном (жидкая фаза) и скошенным агаром (твердая фаза). Для приготовления как бульона, так и агара следует использовать обогащенные различными ростовыми добавками питательные среды (оптимально ТСБ). Газовая среда флакона должна быть насыщена двуокисью углерода.
   Следует отметить, что, несмотря на относительные простоту приготовления и экономические затраты, все же большинство микробиологических лабораторий, при условии их достаточного финансирования, предпочитает использовать для выделения гемокультур готовые коммерческие флаконы.
   Это связано с тем, что среды лабораторного приготовления, как правило, являются недостаточно питательными, а газовый состав флакона не обеспечивает оптимального культивирования микроорганизмов, находящихся в образце крови. Поэтому и частота выделения микроорганизмов из крови при использовании флаконом лабораторного приготовления существенно ниже, чем при использовании готовых коммерческих флаконов.
   Флаконы, изготавливаемые промышленным путем (коммерческие), можно разделить в свою очередь на две группы:
   – для ручного культивирования (manual blood culture bottles);
   – для автоматического культивирования (blood culture bottles for automated blood culture systems).
   Вторые отличаются от первых наличием встроенного в днище флакона колориметрического (BacT/Alert) или флюоресцентного (Bactec 9000) сенсора и присутствием в жидкой основе различных адсорбирующих добавок для удаления из нее потенциально токсических органических компонентов, в том числе и антибиотиков.
   Современные автоматические методы исследования гемокультуры позволяют зафиксировать рост микроорганизмов уже в течение первых 24 ч инкубации (сенсор), что позволяет еще через 24–48 ч получить точную идентификацию возбудителя и его антибиотикограмму [3].
   Таким образом, положительной стороной готовых коммерческих флаконов является:
   – Богатая питательная основа, содержащая сывороточные белки, аминокислоты и различные ростовые добавки.
   – Газовая атмосфера: частичный вакуум, контролируемый состав: повышенное содержание двуокиси углерода (аэробные флаконы) или смесь двуокиси углерода и азота (анаэробные флаконы).
   – Наличие антикоагулянта [0,035% sodium polyanethol sulfonate (SPS)], нейтрализующего бактерицидное действие сыворотки крови.   

Методика культивирования крови
   
Время инкубирования
   При использовании флаконов для ручного культивирования как лабораторного, так и промышленного производства (manual blood culture bottles), их следует инкубировать при температуре 35–37°C и дважды в день (хотя бы в течение первых 3 дней) визуально проверять на наличие микробного роста. О стерильности свидетельствует красный слой крови на дне флакона, покрытый бледно-желтым бульоном.
   О наличии микробного роста свидетельствует:
   – хлопьевидный осадок на поверхности слоя крови;
   – помутнение либо всей среды, либо ее поверхностной части;
   – гемолиз;
   – коагуляция бульона;
   – пленка на поверхности;
   – газообразование;
   – белые крупинки на поверхности или внутри кровяного слоя.
   Как только визуально будет обнаружен микробный рост, флаконы следует асептически вскрыть; стерильной бактериологической петлей или пастеровской пипеткой взять небольшое количество бульона, приготовить окрашенный по Граму мазок и исследовать его на наличие микроорганизмов.
   Субкультивирование осуществляют путем посева полной бактериологической петли проросшего бульона на соответствующую плотную питательную среду:
   – Грамотрицательные палочки – агар Мак-Конки (агар Эндо), агар Клиглера с железом, полужидкий агар для определения подвижности, продукции индола и уреазной активности, агар Симонса (цитратный агар).
   – Стафилококки – кровяной агар, желточно-солевой (манитно-солевой) агар.
   – Стрептококки – кровяной агар с оптохином, бацитроцин и диски с теллуритом, желчно-эскулиновый агар.
   Хотя ныне действующие нормативы [1] и предписывают выдавать отрицательный ответ не ранее 10 дней от момента инкубации образца крови, как показала практика, при проведении рутинных исследований нет необходимости проводить инкубацию крови более 7 дней. В некоторых случаях инкубация может быть продолжена еще в течение 7 дней; это целесообразно, если имеется подозрение на наличие бруцелл или других весьма требовательных к питательным средам микроорганизмов, в случаях эндокардитов или если пациент получает антибиотики.
   Слепое культивирование
   Рост некоторых микроорганизмов не сопровождается помутнением или другими видимыми изменениями бульона. Другие микроорганизмы, такие как пневмококки, имеют тенденцию к аутолизу и быстро погибают. Для обнаружения этих микробов рекомендуется проводить через каждые 48 ч субкультивирование на шоколадном агаре путем инкубации посевов в течение 18–24 ч или использовать коммерческие флаконы с двухфазной средой.   

Контаминанты
   
Загрязнения крови посторонней микрофлорой можно избежать, тщательно обрабатывая кожу пациента и скрупулезно соблюдая правила асептики при выполнении всех лабораторных процедур. Тем не менее даже в идеальных условиях 3–5% проб крови оказываются загрязненными посторонней микрофлорой. С кожи в кровь попадают S. epidermidis, P. acnes, Clostridium spp., Diphteroides, из внешней среды – Acinetobacter spp., Bacillus spp. Однако эти же микроорганизмы иногда могут быть этиологическими факторами заболеваний, даже таких как эндокардиты. Для дифференциации истиной патогенетической роли микроорганизмов необходимо учитывать следующие факторы:
   – Рост одного и того же микроорганизма в двух флаконах при посеве пробы крови от одного пациента, взятых с интервалом во времени.
   – Обнаружение одного и того же микроорганизма в посевах двух и более проб крови.
   – Быстрый рост микроорганизма (в течение 48 ч).
   – Проявление одинаковых биологических свойств и профилей чувствительности к антибиотикам у разных изолятов, полученных из одной пробы крови.
   Выделение двух и более агентов может свидетельствовать как о полимикробной бактериемии, характерной для ослабленных пациентов, так и о контаминации пробы посторонней микрофлорой. "Анаэробная" бактериемия чаще обусловлена множественными патогенами. Например, один или несколько анаэробов могут быть ассоциированы с одним или несколькими аэробами. Это происходит при молниеносной бактериемии, связанной с тяжелой травмой или хирургическим вмешательством на толстом кишечнике.   

Определение чувствительности выделенных гемокультур к антибиотикам
   
В зависимости от вида выделенной гемокультуры используют следующие методы:
   – При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов энтеробактерий и стафилококков рекомендуется использовать метод Кирби–Бауэра [5].
   – При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов стрептококков (в том числе пневмококка), неферментирующих грамотрицательных палочек, гемофильных палочек и дрожжеподобных грибов рекомендуется использовать коммерческие тест-системы ("стрипы"), представляющие из себя набор тех или иных антибиотиков, представленных в двух концентрациях. Это метод (break point) позволяет избежать трудоемкости стандартного метода серийных разведений, но не теряет при этом его главного достоинства – количественного определения минимальной подавляющей концентрации препарата, соответствующей терапевтической концентрации антибиотика в организме [6].   

Литература:
1. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985.
2. Vandepitte J, Engbaek K, Piot P, Heuck CC. Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии/Пер. с англ. Женева. ВОЗ. 1994; 43–51: 117–8.
3. Яковлев С.В. Инфекции и антимикробная тер. 2001; 3 (3): 90–2.
4. Правила забора и доставки биоматериала для лабораторных исследований. Методические рекомендации МЦ УД ПРФ. М., 1997; 62.
5. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков. Методические указания МЗ СССР №2675-83 от 10.03.1983.
6. Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г. Практические аспекты современной клинической микробиологии. М.: Лабинформ 1997; 52–102.



В начало
/media/infektion/02_01/27.shtml :: Wednesday, 03-Jul-2002 20:31:05 MSD
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster