Consilium medicum начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

ИНФЕКЦИИ И АНТИМИКРОБНАЯ ТЕРАПИЯ  
Том 04/N 6/2002 АКТУАЛЬНАЯ ТЕМА

Бета-лактамазы расширенного спектра: клиническое значение и методы детекции


С.В.Сидоренко

Государственный научный центр по антибиотикам, Москва

Введение
   
Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием их широкого клинического применения. В различные периоды времени в зависимости от структуры применения антибиотиков наиболее распространенными являются те или иные механизмы резистентности. В течение последних 20 лет цефалоспориновые антибиотики, прежде всего представители III поколения, прочно удерживают одно из лидирующих положений в лечении широкого круга тяжелых инфекций, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами. Однако и эти антибиотики не стали исключением из общего правила, уже вскоре после их внедрения были описаны микроорганизмы, проявляющие к ним устойчивость. Известно несколько механизмов резистентности микроорганизмов к цефалоспоринам III поколения, однако основным из них является ферментативный гидролиз бета-лактамазами. Из всего разнообразия этих ферментов наибольшую угрозу представляют так называемые бета-лактамазы расширенного спектра – БЛРС (Extended spectrum beta-lactamases – ESBL). Благодаря плазмидной локализации генов распространение этих ферментов среди возбудителей инфекционных болезней человека, прежде всего – инфекций, приняло угрожающий характер. К практически важной особенности БЛРС следует отнести трудность их детекции в рутинной практике. Настоящая работа посвящена характеристике бета-лактамаз расширенного спектра, проблемам их клинического значения и детекции в лабораторной практике.   

Происхождение бета-лактамаз
   
Механизм антибактериального действия бета-лактамных антибиотиков заключается в подавлении функциональной активности бактериальных ферментов транспептидаз, участвующих в завершающей стадии синтеза основного компонента клеточной стенки микроорганизмов – пептидогликана. Благодаря способности связываться с пенициллином транспептидазы получили название "пенициллинсвязывающих белков" (ПСБ). С пенициллином и другими бета-лактамными антибиотиками связываются также ферменты бета-лактамазы. Бета-лактамазы и ПСБ проявляют значительную степень гомологии, что подтверждает гипотезу об их генетическом родстве и наличии у обеих групп ферментов общего предшественника.
   Предполагается, что бета-лактамазы эволюционировали из ПСБ в почвенных экосистемах в результате селективного прессинга бета-лактамных антибиотиков, продуцируемых некоторыми микроорганизмами. Родословное дерево бета-лактамаз и ПСБ приведено на рис. 1 [1]. Все известные в настоящее время бета-лактамазы делят на 4 молекулярных класса, в пределах которых ферменты характеризуются общностью свойств и выраженной гомологией [2]. Ферменты класса В относятся к металлоэнзимам, поскольку в качестве кофермента в них присутствует атом цинка. Бета-лактамазы классов А, С и D относятся к ферментам "серинового" типа (по аминокислоте, находящейся в активном центре фермента). Все известные ПСБ относятся к ферментам "серинового" типа. Необходимо отметить, что, вероятно, вначале, из общего предшественника, возникли несколько линий ПСБ, а затем в результате независимых процессов из них выделились отдельные классы бета-лактамаз.
Рис. 1. Предполагаемое родословное дерево бета-лактамаз и ПСБ.

Рис. 2. Схема ферментативного гидролиза бета-лактамного кольца бета-лактамазами "серинового" типа. В результате реакции свободной гидроксильной группы аминокислоты серина, входящей в активный центр фермента, с бета-лактамным кольцом образуется нестабильный ацилэфирный комплекс, быстро подвергающийся гидролизу. В результате гидролиза высвобождается активная молекула фермента и разрушенная молекула антибиотика.

 

Таблица 1. Классификация бета-лактамаз

Группа

Класс

Преимущественный субстрат

Ингибиция
Клав/ЭДТЭА

Типичные представители

1

C

Цефалоспорины

-

-

AmpC ферменты грамотрицательных бактерий; MIR-1

2a

A

Пенициллины

+

-

Пенициллиназы грамположительных бактерий

2b

A

Пенициллины, цефалоспорины

+

-

TEM-1, TEM-2, SHV-1

2be

C

Пенициллины, цефалоспорины узкого и широкого

+

-

TEM-3 – TEM-26, SHV-2 – SHV-6,

   

спектров, монобактамы

   

Klebsiella oxytoca K1

2br

A

Пенициллины

+/-

-

TEM-30 – TEM-36, TRC-1

2c

A

Пенициллины, карбенициллин

+

-

PSE-1, PSE-3, PSE-4

2d

D

Пенициллины, клоксациллин

+/-

-

OXA-1 – OXA-11, PSE-2 (OXA-10)

2e

A

Цефалоспорины

+

-

Индуцибельные цефалоспориназы из Proteus

2f

A

Пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы

+

-

NMC-A из Enterobacter cloacae, Sme-1 из Serratia

3

B

Большинство бета-лактамов, включая карбапенемы

-

+

L1 из Xanthomonas maltophilia, CcrA из Bacteroides fragilis

4

ND

Пенициллины

-

-

Пенициллиназы из Pseudomonas cepacia

Таблиц 2. Критерии для выявления штаммов Klebsiella spp. и E. coli, подозрительных на продукцию БЛРС

Антибиотик

Диаметр зоны ингибиции, мм

Величина МПК, мкг/мл

Цефподоксим

<22

>2,0

Цефтазидим

<22

>2,0

Азтреонам

<27

>2,0

Цефотаксим

<27

>2,0

Цефтриаксон

<25

>2,0

Рис. 3. Родословное дерево известных бета-лактамаз.

Рис. 4. Детекция БЛРС методом двух дисков. Схематическое изображение зоны ингибиции роста вокруг дисков с амоксициллином/клавуланатом (АМС) и цефтазидимом (CAZ).

Рис. 5. Детекция БЛРС с помощью Е-теста.

   Между "сериновыми" бета-лактамазами и ПСБ существует много общего и в механизмах взаимодействия с бета-лактамными антибиотиками. В результате реакции свободной гидроксильной группы аминокислоты серина с бета-лактамным кольцом антибиотиков образуется эфирный комплекс. При взаимодействии бета-лактамных антибиотиков и ПСБ образующийся комплекс оказывается достаточно стабильным, благодаря чему и подавляется функциональная активность ПСБ. Комплекс, образующийся при взаимодействии антибиотиков и бета-лактамаз, оказывается крайне нестабильным. В результате его гидролиза высвобождается активная молекула фермента и разрушенная молекула антибиотика (рис. 2). В течение секунды одна молекула фермента может разрушить до 1000 молекул антибиотика.
   Здесь же целесообразно упомянуть об ингибиторах бета-лактамаз. Известные ингибиторы представляют собой бета-лактамные структуры, проявляющие низкую аффинность к ПСБ, но образующие стабильные комплексы с бета-лактамазами. Благодаря способности подавлять активность бета-лактамаз ингибиторы защищают от гидролиза чувствительные антибиотики.   

Характеристика и классификация бета-лактамаз
   
С практической точки зрения при характеристике бета-лактамаз необходимо учитывать несколько параметров:

   Исчерпывающие данные по классификации бета-лактамаз можно найти в обзоре K. Bush и соавт. [3]. В сокращенном виде классификация представлена в табл. 1.

Распространение бета-лактамаз среди клинически значимых микроорганизмов
   
Поскольку бета-лактамазы играют важную роль в экологии ряда микроорганизмов, они широко распространены в природе. Так, в хромосомах многих видов грамотрицательных микроорганизмов гены бета-лактамаз обнаруживаются в естественных условиях. Очевидно, что внедрение в медицинскую практику антибиотиков коренным образом
изменило биологию микроорганизмов. Хотя детали этого процесса не известны, можно предполагать, что некоторые из хромосомных бета-лактамаз оказались мобилизованными в состав подвижных генетических элементов (плазмид и транспозонов). Селективные преимущества, которые обеспечивали микроорганизмам обладание этими ферментами, привели к быстрому распространению последних среди клинически значимых патогенов.
   К наиболее распространенным ферментам с хромосомной локализацией генов относятся бета-лактамазы класса С (группа 1 по Bush). Гены этих ферментов обнаруживаются в хромосомах практически всех грамотрицательных бактерий. Их общими свойствами являются:

   Для бета-лактамаз класса С с хромосомной локализацией генов характерны особенности экспрессии. У некоторых микроорганизмов (например, E. coli) хромосомные бета-лактамазы экспрессируются постоянно, но на очень низком уровне, недостаточном даже для гидролиза ампициллина. Для микроорганизмов группы Enterobacter, Serratia, Morganella и др. характерен индуцибельный тип экспрессии. При отсутствии в среде антибиотиков фермент практически не вырабатывается, но после контакта с некоторыми бета-лактамами скорость синтеза резко возрастает. При нарушении регуляторных механизмов возможна постоянная гиперпродукция фермента.
   Несмотря на то что в настоящее время уже описано более 20 бета-лактамаз класса С, локализованных на плазмидах, эти ферменты еще не получили широкого распространения, однако уже в ближайшем будущем они могут составить реальную клиническую проблему.
   Хромосомные бета-лактамазы
K. pneumoniae, K. oxytoca, C. diversus и P. vulgaris относятся к классу А, для них также характерны различия в экспрессии. Однако даже в случае гиперпродукции этих ферментов микроорганизмы сохраняют чувствительность к некоторым цефалоспоринам III поколения. Хромосомные бета-лактамазы клебсиелл относят к группе 2be по Bush, а бета-лактамазы C. diversus и P. vulgaris – к группе 2е.
   По не совсем понятным причинам мобилизация бета-лактамаз класса А на подвижные генетические элементы происходит эффективнее, чем ферментов класса С. Так, есть все основания предполагать, что широко распространенные среди грамотрицательных микроорганизмов плазмидные бета-лактамазы SHV-1 и их производные произошли от хромосомных бета-лактамаз
K. pneumoniae.
   Бета-лактамазы класса А грамположительных бактерий. Исторически первыми бета-лактамазами, вызвавшими серьезные клинические проблемы, были стафилококковые бета-лактамазы (группа 2а по Bush). Эти ферменты эффективно гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, возможен также частичный гидролиз цефалоспоринов I поколения, они проявляют чувствительность к действию ингибиторов (клавуланату, сульбактаму и тазобактаму). Гены ферментов локализуются на плазмидах, что обеспечивает их быстрое внутри- и межвидовое распространение среди грамположительных микроорганизмов. Уже к середине 50-х годов в ряде регионов более 50% штаммов стафилококков продуцировали бета-лактамазы, что привело к резкому снижению эффективности пенициллина. К концу 90-х годов частота продукции бета-лактамаз среди стафилококков практически повсеместно превосходит 70–80%.
   У грамотрицательных бактерий первая плазмидная бета-лактамаза класса А (ТЕМ-1) была описана в начале 60-х годов, вскоре вслед за внедрением в медицинскую практику аминопенициллинов [4]. Благодаря плазмидной локализации генов, TEM-1 и две другие бета-лактамазы класса А (TEM-2, SHV-1) в течение короткого времени распространились среди представителей семейства
Enterobacteriaceae и других грамотрицательных микроорганизмов практически повсеместно. Перечисленные ферменты получили название бета-лактамаз широкого спектра. По классификации Bush бета-лактамазы широкого спектра относятся к группе 2b. Их практически важным свойствам являются:
   Способность гидролизовать природные
и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины I поколения, частично цефоперазон и цефамандол

   Период с конца 60-х и до середины 80-х годов отмечен интенсивным развитием бета-лактамных антибиотиков, в практику были внедрены карбокси- и уреидопенициллины, а также цефалоспорины трех поколений. По уровню и спектру антимикробной активности, а также по фармакокинетическим характеристикам эти препараты существенно превосходили аминопенициллины. Большинство цефалоспоринов II и III поколения, кроме этого, оказались устойчивыми к бета-лактамазам широкого спектра.
   В течение некоторого времени после внедрения в практику цефалоспоринов II
III поколений приобретенной устойчивости к ним среди энтеробактерий практически не отмечали. Однако уже в начале 80-х годов появились первые сообщения о штаммах с плазмидной локализацией детерминант устойчивости к этим антибиотикам [5]. Достаточно быстро было установлено, что эта устойчивость связана с продукцией микроорганизмами ферментов, генетически связанных с бета-лактамазами широкого спектра (TEM-1 и SHV-1), новые ферменты получили название бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС).
   Первым идентифицированным ферментом расширенного спектра была бета-лактамаза ТЕМ-3 [6]. К настоящему времени известно около 100 производных фермента ТЕМ-1. Производные отличаются от исходного фермента единичными аминокислотными заменами. Из приблизительно 300 аминокислот, входящих в состав молекулы бета-лактамазы ТЕМ-1 замены, приводящие к формированию нового фенотипа, возникают не более чем в 16. Чаще всего бета-лактамазы ТЕМ-типа встречаются среди
E. coli и K. pneumoniae, однако их обнаружение возможно практически среди всех представителей Enterobacteriaceae и ряда других грамотрицательных микроорганизмов. Производные фермента SHV-1 менее многочисленны, их описано около 30, они также отличаются от своего предшественника единичными аминокислотными заменами. Ферменты SHV-типа чаще всего встречаются у K. pneumoniae, но возможны находки и у других грамотрицательных микроорганизмов.
   По классификации Bush бета-лактамазы ТЕМ- и SHV-типа относятся к группе 2be. Практически важными свойствами БЛРС являются следующие:

   Среди бета-лактамаз TEM- и SHV-типа описаны ферменты со своеобразным фенотипом. Они не чувствительны к действию ингибиторов (клавуланата и сульбактама, но не тазобактама), однако их гидролитическая активность в отношении большинства бета-лактамов ниже, чем у ферментов предшественников. Ферменты, получившие название ингибитор-устойчивые ТЕМ (inhibitor-resistant TEM – IRT), включены в группу 2br по классификации Bush. На практике микроорганизмы, обладающие этими ферментами, проявляют высокую устойчивость к защищенным бета-лактамам, но лишь умеренно устойчивы к цефалоспоринам I–II поколения и чувствительны к цефалоспоринам III–IV поколения. Следует однако отметить, что у отдельных бета-лактамаз сочетаются свойства и устойчивости к ингибиторам и расширенного спектра гидролитической активности.
   Как это ни парадоксально, несмотря на значительное внимание, уделяемое проблеме БЛРС, общепринятое определение этих ферментов отсутствует. D.M. Livermore в обзоре 1995 г. использует термин "бета-лактамазы расширенного спектра" в первую очередь по отношению к ферментам класса А, являющимся производными TEM-1 и SHV-1 [7]. Однако кроме указанных к БЛРС он отнес и представителей других молекулярных классов (С, D и B), при плазмидной локализации их генов. NCCLS не дает четкого определения БЛРС, но в качестве подтверждающего теста при их диагностике указывает на чувствительность этих ферментов к ингибиции клавулановой кислотой. В обзоре 2001 г., посвященном проблеме БЛРС, P. Bradford [8] относит к этой группе только ферменты классов
А и D, относящиеся к группам 2be и 2d по Bush. Общим свойством этих ферментов является чувствительность к ингибиторам. На рис. 3 приведено родословное дерево бета-лактамаз расширенного спектра по Bradford [8].
   К ферментам, количество представителей которых в последние годы достаточно быстро увеличивается, относятся бета-лактамазы СТХ-типа (цефотаксимазы). Как следует из рис. 3, бета-лактамазы СТХ-типа представляют собой четко очерченную группу, отличающуюся от других ферментов класса А. Предпочтительным
субстратом указанных ферментов в отличие от ТЕМ- и SHV-производных является не цефтазидим или цефподоксим, а цефотаксим. Цефотаксимазы обнаруживают у различных представителей Enterobacteriaceae (преимущественно у E. coli и Salmonella enterica) в географически отдаленных регионах земного шара. В то же время в Восточной Европе описано распространение клонально-родственных штаммов Salmonella typhimurium, продуцирующих фермент CTX-M4. По классификации Bush бета-лактамазы СТХ-типа относятся к группе 2be. Происхождение ферментов СТХ-типа неясно. Значительная степень гомологии обнаруживается с хромосомными бета-лактамазами K. oxytoca, C. diversus, P. vulgaris, S. fonticola. Недавно была установлена высокая степень гомологии с хромосомной бета-лактамазой Kluyvera ascorbata.
   Известен также ряд редко встречающихся ферментов, относящихся к классу А и обладающих фенотипом, характерным для БЛРС (способностью гидролизовать цефалоспорины III поколения и чувствительностью к ингибиторам). Эти ферменты (BES-1, FEC-1, GES-1
, CME-1, PER-1, PER-2, SFO-1, TLA-1 и VEB-1) выделяли у ограниченного количества штаммов различных видов микроорганизмов в различных регионах мира от Южной Америки до Японии. Перечисленные ферменты различаются по предпочтительным субстратам (отдельные представители цефалоспоринов III поколения). Большинство из этих ферментов были описаны после публикации работы Bush и соавт., в связи с чем их положение в классификации не определено.
   Бета-лактамазы класса D. К БЛРС относят также ферменты класса D. Их предшественники, бета-лактамазы широкого спектра, гидролизующие преимущественно пенициллин и оксациллин, слабо чувствительны к ингибиторам, распространены в основном в Турции и Франции среди
P. aeruginosa. Гены этих ферментов, как правило, локализованы на плазмидах. Большинство ферментов, демонстрирующих фенотип расширенного спектра (преимущественный гидролиз цефотаксима и цефтриаксона – ОХА-11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 28) происходят от бета-лактамазы ОХА-10. По классификации Bush бета-лактамазы ОХА-типа относятся к группе 2d.
   Бета-лактамазы разных групп. Bush выделяет еще несколько групп ферментов, существенно различающихся по свойствам (в том числе и по спектру действия), но обычно не рассматриваемых как бета-лактамазы расширенного спектра. Для ферментов из группы 2с преимущественными субстратами являются пенициллины и карбенициллин, они встречаются среди
P. aeruginosa, Aeromonas hydrophilia, Vibrio cholerae, Acinetobacter calcoaceticus и некоторых других грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, гены чаще локализованы на хромосомах.
   Для ферментов группы 2е преимущественным субстратом являются цефалоспорины, в качестве типичного примера рассматривают хромосомные индуцибельные цефалоспориназы
P. vulgaris. Бета-лактамазы этой группы описывают также у Bacteroides fragilis и, реже, у других микроорганизмов.
   В группу 2f входят редкие ферменты класса А, способные гидролизовать большинство бета-лактамов, включая карбапенемы. Livermore относит эти ферменты к бета-лактамазам расширенного спектра, другие авторы – нет.
   Кроме перечисленных бета-лактамаз необходимо упомянуть о двух последних группах ферментов, включенных в классификацию Bush. К ферментам группы 3 относятся редкие, но потенциально крайне важные металло-бета-лактамазы класса В, закономерно обнаруживаемые среди Stenotrophomonas maltophilia и редко встречающиеся у других микроорганизмов (
B. fragilis, A. hydrophila, P. aeruginosa и др.). Отличительной особенностью этих ферментов является способность гидролизовать карбапенемы. В группу 4 включены плохо изученные пенициллиназы P. aeruginosa, подавляемые клавулановой кислотой.   

Клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра и критерии устойчивости микроорганизмов-продуцентов
   
Частота распространения БЛРС значительно варьирует в отдельных географических регионах. Так, по данным многоцентрового исследования "MYSTIC", в Европе наибольшую частоту распространения БЛРС стабильно отмечают в России и Польше (более 30% среди всех изученных штаммов энтеробактерий). В отдельных лечебных учреждениях РФ частота продукции БЛРС среди
Klebsiella spp. превышает 90%. В зависимости от специфики лечебного учреждения наиболее распространенными в нем могут быть различные механизмы устойчивости (метициллинрезистентность, устойчивость к фторхинолонам, гиперпродукция хромосомных бета-лактамаз и др.), однако продукция БЛРС закономерно находится среди 2–3 ведущих.
   БЛРС, как уже было сказано, обладают широким спектром активности, в той или иной степени они гидролизуют практически всех представителей бета-лактамных антибиотиков, за исключением цефамицинов и карбапенемов. Однако наличие у микроорганизма детерминанты устойчивости к какому-либо антибиотику далеко не всегда означает клиническую неудачу при лечении этим препаратом. Применительно к микроорганизмам, продуцирующим БЛРС, наиболее остро стоит вопрос о возможности применения для лечения соответствующих инфекций цефалоспоринов III–IV поколения. Решение этого вопроса имеет свою историю и тесно связано с проблемой разработки критериев чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам.
   Критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к цефалоспоринам III поколения Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (National Committee for Clinical Lab
oratory Standards, NCCLS) установил в начале 80-х годов, вскоре после появления первых представителей этой группы антибиотиков в практической медицине. Штаммы энтеробактерий рассматривали как чувствительные при величине МПК 8 мкг/мл и меньше, как резистентные при величине МПК 32 мкг/мл и больше. Однако следует признать, что эти критерии были избраны во многом по аналогии с критериями, установленными для полусинтетических пенициллинов и ранних цефалоспоринов. Предложенные критерии удачно учитывали микробиологические, фармакокинетические и клинические параметры этих препаратов, но не цефалоспоринов III поколения. Диапазон МПК ампициллина в отношении дикой популяции E. coli колеблется в пределах 1–8 мкг/мл, приблизительно такие же концентрации достижимы и в сыворотке крови при парентеральном введении антибиотика, они же обеспечивают высокий клинический эффект. При более высоких значениях МПК ампициллина (32 мкг/мл и выше), что, как правило, связано с продукцией бета-лактамаз широкого спектра, отмечают высокую частоту неудач.
   Приведенные выше критерии были приняты для цефалоспоринов III поколения, несмотря на то что по ряду свойств эти антибиотики существенно отличаются от своих предшественников. Так, МПК цефотаксима и цефтриаксона в отношении дикой популяции
E. coli колеблется в пределах 0,03–0,5 мкг/мл, а максимальные концентрации в сыворотке крови достигают 100 мкг/мл. Эти антибиотики устойчивы к действию бета-лактамаз широкого спектра. Несмотря на то что критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к цефалоспоринам III поколения были недостаточно обоснованы, в течение некоторого времени они удовлетворяли практическим запросам. Проблемы появились после формирования у грамотрицательных микроорганизмов новых механизмов устойчивости.
   В первых сообщениях БЛРС описывали как ферменты, проявляющие высокий уровень устойчивости к цефалоспоринам III поколения (МПК>32–64 мкг/мл). Но к концу 80-х – началу 90-х годов было установлено, что величины МПК некоторых цефалоспоринов в отношении штаммов, продуцирующих БЛРС, могут быть в пределах критериев чувствительности (2–8 мкг/мл), но все же выше, чем для так называемой дикой популяции (0,03–0,5 мкг/мл). Вскоре появились сообщения о снижении клинической эффективности цефалоспоринов III поколения при инфекциях, вызванных штаммами микроорганизмов, продуцирующими БЛРС (но по формальным критериям чувствительными) [9]. Причем снижение касалось только тяжелых и генерализованных инфекций, при инфекциях мочевыводящих путей эффективность этих антибиотиков сохранялась.
  
 В качестве одного из объяснений указанных эффектов приводят наблюдения о наличии выраженного "эффекта инокулюма" при оценке чувствительности штаммов, продуцирующих БЛРС. Этот эффект заключается в резком повышении величины МПК антибиотика (от 1 до 64 мкг/мл и выше) при увеличении посевной дозы возбудителя от 105 КОЕ/мл до 107 КОЕ/мл [10].
   При последующих наблюдениях различными авторами были получены противоречивые данные. Так, имеются сообщения о высокой эффективности цефалоспоринов III поколения при лечении инфекций, вызванных штаммами, продуцирующими БЛРС [11]. В то же время в недавно опубликованной работе были суммированы собственные данные авторов и некоторые из ранее опубликованных сообщений о результатах лечения цефалоспориновыми антибиотиками инфекций, вызванных штаммами
Enterobacteriaceae, продуцирующими БЛРС, но по формальным критериям NCCLS относящимися к чувствительным или промежуточным [12]. Всего удалось получить данные о лечении 32 пациентов. Было установлено, что во всех 4 случаях, когда возбудитель относился к категории промежуточных (МПК=16 мкг/мл), лечение цефалоспоринами было неэффективным. В тех случаях, когда возбудитель относился к формально чувствительным (МПК<8 мкг/мл), неудачи лечения наблюдали в 54% случаев.
   Неоднозначные результаты были получены и при лечении экспериментальных инфекций, вызванных штаммами, продуцирующими БЛРС. Так, несмотря на выраженный "эффект инокулюма", наблюдавшийся in vitro у всех цефалоспоринов, in vivo цефотаксим и цефепим значительно превосходили цефтазидим и практически не уступали имипенему [13]. В ряде других исследований были получены противоположные результаты [14, 15]. Фармакодинамические исследования in vivo свидетельствуют, что продукция БЛРС при величине МПК цефепима до 8 мкг/мл не сказывается на эффективности этого антибиотика при экспериментальных инфекциях [16]. Очевидно, что цефалоспорины III–IV поколения нельзя рассматривать как препараты, полностью идентичные по чувствительности к гидролизу БЛРС, сами ферменты также значительно различаются по способности гидролизовать различные цефалоспорины. Существует точка зрения, не подтвержденная убедительными данными, что при использовании максимальных доз цефалоспоринов III–IV поколения можно добиться высокой эффективности лечения инфекций, вызываемых
продуцентами БЛРС.
   Накопление достоверных данных по эффективности цефалоспориновых антибиотиков при верифицированных инфекциях, вызываемых микроорганизмами, продуцирующими БЛРС, оказывается длительным процессом. Так, авторам работы [12] в течение 2 лет
, в ходе многоцентрового исследования удалось документировать только 10 случаев лечения цефалоспоринами тяжелых инфекций, вызванных микроорганизмами, продуцирующими БЛРС. Очевидно, что окончательно вопрос об эффективности цефалоспоринов при инфекциях, вызываемых продуцентами БЛРС, будет решен не скоро.
   Несмотря на неоднозначность и неполноту микробиологических и клинических данных, NCCLS предложил рекомендации, согласно которым штаммы
E. coli и Klebsiella spp., продуцирующие БЛРС, необходимо рассматривать как устойчивые к пенициллинам, цефалоспоринам и азтреонаму [17]. Такой подход следует считать оправданным, поскольку он позволяет снизить риск фатальных неудач при лечении тяжелых инфекций.
   В то же время NCCLS не пересматривает критерии чувствительности представителей семейства
Enterobacteriaceae к цефалоспоринам, что создает определенные трудности для практических бактериологов и клиницистов.
   Учитывая тот факт, что на сегодняшний день цефалоспорины являются основой терапии тяжелых и крайне тяжелых внебольничных и госпитальных инфекций, выполнение рекомендаций NCCLS резко ограничивает возможность антибактериальной терапии. Штаммы микроорганизмов, продуцирующих БЛРС, с высокой частотой демонстрируют ассоциированную устойчивость к антибиотикам других групп. Частота ассоциированной устойчивости к гентамицину может достигать 80%, к ципрофлоксацину – 40–60% [18]. В определенной части случаев в связи с эффектом гиперпродукции БЛРС неэффективными при соответствующих инфекциях оказываются и ингибиторзащищенные бета-лактамы. В подобной ситуации единственными средствами, сохраняющими высокий уровень эффективности, остаются карбапенемы.
   В то же время массовое эмпирическое назначение карбапенемов связано со значительными финансовыми затратами и высоким риском быстрой селекции устойчивости к этим антибиотикам среди
P. aeruginosa. Таким образом, необходимость эффективной лабораторной диагностики продукции грамотрицательными микроорганизмами БЛРС становится очевидной. Однако результаты контрольных исследований свидетельствуют, что в большинстве стран мира эффективность детекции продукции БЛРС оставляет желать лучшего. Так, по результатам внешнего контроля качества ВОЗ в 5,4% лабораторий штаммы, продуцирующие БЛРС, были оценены как полностью чувствительные ко всем цефалоспоринам, лишь в 2 из 130 лабораторий в результатах была отдельно отмечена продукция БЛРС [19].

Методы детекции бета-лактамаз расширенного спектра и интерпретация результатов
   
Прежде всего следует отметить, что рекомендации NCCLS распространяются только на штаммы
Klebsiella spp. и E. coli. В то же время продукция БЛРС описана практически у всех представителей семейства Enterobacteriaceae и ряда других грамотрицательных микроорганизмов. Вопрос о том можно ли применять рекомендации NCCLS по скринингу и фенотипическому подтверждению продукции БЛРС, например к штаммам Proteus vulgaris или Citrobacter diversus, не решен.
   Рекомендации предполагают скрининг всех исследуемых в лаборатории штаммов
Klebsiella spp. и E. coli на возможность продукции БЛРС и последующее проведение подтверждающих исследований с подозрительными штаммами.
   Скрининг не предполагает проведения специального исследования, его основу составляет анализ данных, получаемых в рутинной практике. В то же время без соответствующей организации работы эффективное выявление БЛРС невозможно.
   Признаком вероятной продукции микроорганизмом БЛРС является повышение МПК хотя бы к одному из цефалоспоринов до 2 мкг/мл и более (либо эквивалентное уменьшение зоны ингибиции роста).
   Соответственно, для эффективного скрининга в рутинное микробиологическое исследование необходимо включать несколько цефалоспориновых антибиотиков, даже если использование некоторых из них в качестве терапевтических препаратов не планируется. Чем больше использовано цефалоспоринов для тестирования, тем вероятнее детекция БЛРС. Это связано с тем, что каждый из более чем 130 ферментов расширенного спектра обладает своим характерным субстратным профилем, соответственно, возможное разнообразие фенотипов весьма велико. Некоторые штаммы могут проявлять высокий уровень устойчивости ко всем антибиотикам, у других же будет обнаруживаться лишь незначительное повышение МПК к 1–2 цефалоспоринам. Критерии чувствительности
Klebsiella spp. и E. coli к цефалоспоринам, позволяющие рассматривать штаммы этих микроорганизмов как подозрительные на продукцию БЛРС, приведены в табл. 2.
   Считается, что из всех цефалоспоринов наиболее чувствительными к гидролизу БЛРС являются цефподоксим и цефтазидим. Соответственно, хотя из этого правила и существуют
многочисленные исключения, включение указанных антибиотиков в набор по оценке чувствительности весьма целесообразно.
   Однако учитывая значительные трудности с материальным обеспечением, испытываемые многими практическими лабораториями, следует указать, что в минимальный набор цефалоспоринов III поколения, включаемых в исследования по оценке антибиотикочувствительности грамотрицательных микроорганизмов, должны входить:

  Здесь же уместно подчеркнуть, что цефтазидим включен в набор только как маркер на потенциальную продукцию БЛРС. Использование этого антибиотика для лечения инфекций, вызванных микроорганизмами, отличными от P. aeruginosa и других неферментирующих, нецелесообразно.
   После выявления штамма, подозрительного на продукцию БЛРС, NCCLS рекомендует провести подтверждающий тест. Необходимость в подтверждающих исследованиях связана с тем, что кроме продукции БЛРС к незначительному увеличению МПК цефалоспоринов в отношении грамотрицательных микроорганизмов может привести повышение уровня продукции хромосомных бета-лактамаз класса С, снижение проницаемости пориновых каналов и, возможно, другие причины. Ни при одном из указанных механизмов резистентности при сохранении МПК в пределах до 8 мкг/мл не обнаружено снижения клинической эффективности цефалоспоринов.   

Тесты, подтверждающие продукцию БЛРС
   
После выявления клинической значимости БЛРС был предложен ряд тестов для подтверждения их продукции. Тесты можно разделить на традиционные микробиологические и молекулярные.   

Традиционные микробиологические тесты
   
Рекомендованные NCCLS тесты являются вариантами стандартных методов оценки антибиотикочувствительности и основаны на ингибиции БЛРС клавуланатом. В ходе их постановки сравнивается чувствительность исследуемых микроорганизмов к цефалоспоринам III поколения (обычно к цефтазидиму и цефотаксиму) и к комбинации этих антибиотиков с клавулановой кислотой.
   В диско-диффузионном методе используются стандартные диски с обычным содержанием цефотаксима и цефтазидима (по 30 мкг на диск), а также диски, содержащие комбинации: цефотаксим + клавуланат и цефтазидим + клавуланат (30 мкг цефалоспорина + 10 мкг клавуланата). В исследование целесообразно включать диски с обоими цефалоспоринами и их комбинациями с клавуланатом.

   В методе серийных разведений в бульоне используют 2-кратные серийные разведения препаратов в следующих диапазонах концентраций: цефтазидим – от 0,25 мкг/мл до 128 мкг/мл; цефтазидим/клавуланат – от 0,25/4 мкг/мл до 128/4 мкг/мл; цефотаксим – от 0,25 мкг/мл до 64 мкг/мл; цефотаксим/клавуланат – от 0,25/4 мкг/мл до 64/4 мкг/мл. В исследование целесообразно включать оба цефалоспорина и их комбинации с ингибитором.

   Метод двух дисков (double-disk approximation test). Хотя этот метод и не относится к рекомендованным NCCLS, чувствительность, специфичность и простота постановки позволяют рассматривать его как практически наиболее приемлемый. Метод предполагает использование наиболее доступных коммерческих дисков: с амоксициллином/клавуланатом и дисков с одним из цефалоспоринов III поколения.
   Методика постановки (среды, инокуляция, инкубация и т.д.) полностью соответствует рекомендациям NCCLS.
   На чашу Петри с агаром Mueller-Hinton, предварительно засеянную исследуемым микроорганизмом, накладывают диск с амоксициллином/клавуланатом, а на расстоянии 30,0 мм от него – диск с одним из цефалоспоринов III поколения (расстояние измеряется от центров дисков). Возможны варианты наложения 2 и 3 дисков с различными цефалоспоринами вокруг диска с амоксициллином клавуланатом. Если исследуемый микроорганизм продуцирует БЛРС, чувствительные к клавуланату, зона ингибиции роста вокруг диска с цефалоспорином окажется "вытянутой" в сторону диска с амоксициллином/клавуланатом, в значительной части случаев наблюдают слияние зон. Причиной наблюдаемого эффекта является дополнительное подавление роста микроорганизма в той зоне, куда диффундируют и клавуланат и цефалоспорин. Схематическое изображение зоны ингибиции роста вокруг двух дисков представлено на рис. 4. Тест сугубо качественный
и требует определенных навыков при интерпретации.
   Е-тест. Для детекции БЛРС существуют специальные полоски Е-теста, позволяющие одновременно оценивать МПК и цефтазидима и комбинации цефтазидима с клавулановой кислотой. Такие полоски состоят из двух половин. Одна половина предназначена для оценки МПК цефтазидима, другая – цефтазидима/клавуланата. Для интерпретации результатов используют те же критерии, что и при использовании метода серийных разведений. Признаком продукции БЛРС является разница в 3 разведения между МПК цефтазидима и комбинации цефтазидима с клавуланатом. Результаты положительного Е-теста приведены на рис. 5. В целом Е-тест достаточно удобен, однако при низких значениях МПК цефтазидима могут возникать затруднения с учетом результатов из-за
изменения формы зоны задержки роста вследствие диффузии клавуланата из одной половины полоски в сторону другой.
   Коммерческие тесты (“Vitek”). Существуют также коммерческие тест-системы, предназначенные для детекции продукции БЛРС. Они основаны на сравнении МПК цефалоспоринов без ингибиторов и цефалоспоринов в комбинации с клавуланатом. Критерии интерпретации результатов те же, что и для метода серийных разведений.
   К сожалению, ни один из традиционных микробиологических методов, основанных на оценке фенотипа микроорганизма, не обеспечивает детекцию БЛРС у 100% штаммов. Так, например, коммерческие тест-системы “Vitek” оказываются малоэффективными при детекции БЛРС у представителей рода
Enterobacter [20]. Ситуация существенно затрудняется в достаточно часто встречающихся случаях наличия у микроорганизмов нескольких детерминант устойчивости одновременно. Например, при продукции БЛРС и гиперпродукции хромосомных бета-лактамаз класса С устойчивость последних к клавуланату маскирует присутствие БЛРС.   

Молекулярные методы детекции БЛРС
   
Перечисленные традиционные микробиологические методы детекции БЛРС в лучшем случае позволяют оценить факт наличия фермента, однако они ни в коем случае не могут дать информации о том, какой именно из 130 ферментов присутствует.
   ДНК-зонды. Метод ДНК-зондов является весьма трудоемким, он позволяет осуществлять групповую детекцию ферментов, например ТЕМ-тип или SHV-тип. Однако дифференцировать ферменты внутри указанных групп с помощью обычных ДНК-зондов невозможно.
   ПЦР. Быстрым и экономичным методом детекции БЛРС является амплификация генов-мишеней в ПЦР. При использовании олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативным участкам генов бета-лактамаз отдельных групп, возможна эффективная групповая детекция ферментов (ТЕМ-, CSV-, СТХ- и ОХА-типов). Однако дифференцировка внутри указанных групп ферментов при использовании ПЦР невозможна.
   Секвенирование. “Золотым стандартом” молекулярного типирования БЛРС является секвенирование генов этих ферментов. Наиболее распространенным подходом является амплификация генов бета-лактамаз из тотальной ДНК штаммов фенотипически подозрительных на продукцию БЛРС. Для амплификации используют праймеры, специфичные для ферментов отдельных групп (ТЕМ-, CSV-, СТХ- и ОХА-типов и др.). Продукты амплификации подвергаются секвенированию, полученные результаты сравнивают с известными нуклеотидными последовательностями ферментов из международных банков данных. Использование секвенирования позволяет идентифицировать не только известные, но и новые варианты ферментов.
   Основным недостатком секвенирования является значительная трудоемкость и сравнительно высокая стоимость. Однако постоянное совершенствование оборудования достаточно быстро снижает значимость этих недостатков.
   К настоящему времени разработан также ряд методов молекулярного типирования БЛРС без секвенирования их генов.
   Олиготипирование. Метод основан на использовании наборов олигонуклеотидных зондов, позволяющих выявлять точечные мутации в генах известных бета-лактамаз. Олигонуклеотидные зонды используют для реакции гибридизации в жестких условиях. Для детекции продуктов гибридизации используют радиоактивную или биотиновую метки.
   На использовании олигонуклеотидных зондов основаны технологии ДНК-чипов. В соответствии с этими
технологиями на небольшом по площади носителе (1–2 см2) можно разместить 100 тыс. и более индивидуальных олигонуклеотидных зондов.
   Разработка ДНК-чипов является наиболее перспективным направлением создания молекулярных методов микробиологической диагностики.
   PCR-RFLP, PCR-SSCP. Ряд методов типирования БЛРС основан на амплификации генов ферментов и последующем анализе продукта амплификации.
   Анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (PCR-RFLP). При обработке амплифицированного гена различными рестриктазами количество, размер рестрикционных фрагментов будут зависеть от наличия или отсутствия мутаций в сайтах узнавания рестриктаз. При подборе соответствующих рестриктаз в результате сравнения электрофореграмм исследуемого и стандартного штаммов можно выявить практически все известные мутации в мутации в генах TEM-1 и SHV-1 бета-лактамаз и таким образом идентифицировать известные варианты БЛРС.
   Известны также удачные примеры использования анализа полиморфизма коформации одноцепочечных фрагментов
(PCR-SSCP). При использовании этого метода амплифицированный продукт подвергается денатурации с получением одноцепочечных фрагментов. Электрофоретическая подвижность полученных фрагментов зависит от их размера и вторичной структуры. Вторичная структура в свою очередь определяется нуклеотидной последовательностью. При наличии в амплифицированном фрагменте точечных мутаций его подвижность будет отличаться от стандартной. Использование метода позволяет выявить значительную часть известных точечных мутаций в гене SHV-1 и таким образом идентифицировать отдельные производные этого фермента.

Заключение
   
Бета-лактамазы расширенного спектра относятся к детерминантам резистентности, распространение которых представляет наибольшую угрозу целой группе антибактериальных препаратов – цефалоспоринам различных поколений. Разработанные методы позволяют достаточно эффективно осуществлять детекцию этих ферментов у клинически значимых микроорганизмов. Однако в значительной части лечебно-профилактических учреждений детекция БЛРС не проводится, что связано с недооценкой значения этого механизма устойчивости. Своевременная и правильная детекция БЛРС позволит существенно повысить эффективность антибактерилаьной терапии тяжелых инфекций.   

Литература
1. Massova I, Mobashery S. Ant
imicrob Agents Chemother 1998; 42: 1–12.
2. Ambler RP. The structure of b-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 1980; 289: 321–31.
3. Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. Antimicrob. Agents Chemother 1995; 39: 1211–33.
4. Datta N, Kontomichalou P. Nature 1965; 208: 239–44.
5. Knothe A, Shah P, Krоmery V et al. Infection 1983;11: 315–7.
6. Sougakoff W, Goussard S, Courvalin P. FEMS Microbiol Lett 1988; 56: 343–8.
7. Livermore DM. Clin Microbiol Rev 1995; 8: 557–84.
8. Bradford PA. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 933–51.
9. Brun
-Buisson C, Philippon A, Ansquer M et al. Lancet 1987; i: 302–6.
10. Medeiros AA, Crellin J. Pediatr Infect Dis J 1997; 16: S49–S55.
11. Emery CL, Weymouth LA. J Clin Microbiol 1997; 35: 2061–7.
12. Paterson DL, Ko W-C, Von Gotberg A et al. J Clin Microbiol 2001; 36: 2206–12.
13. Thauvin-Eliopoulos C, Tripodi M-F, Moellering RC et al. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1053–7.
14. Fantin B, Pangon B, Potel G et al. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 581–6.
15. Rice LB, Yao JDC, Klimm K et al. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35: 1243–4.
16. Wiener J, Quinn JP, Bradford PA et al. JAMA 1999; 281: 517–23.
17. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7–A5, 5th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa.
18. Andes D, Craig WA. Impact of Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) Production on the Activity of Cefepime in a Murine-Thigh Infection Model. Abstracts of the 41th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, December 2001.
19. Tenover FC, Mohammed MJ, Stelling J et al. J Clin Microbiol 2001; 39: 241–50.
20. Tzelepi E, Giakkoupi P, Sofianou D et al. J Clin Microbiol 2000; 38: 542–6.



В начало
/media/infektion/02_06/164.shtml :: Wednesday, 26-Mar-2003 21:58:34 MSK
© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster